|
АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология
|
Дополнение 9.1 Кинетика ренатурации ДНК
Этапы последовательной денатурации и ренатурации ДНК схематически изображены на рис. 9.1. Ренатурация комплементарных одноцепочечных молекул в двухцеп очечную происходит в два этапа: 1) нуклеация (зацепление), 2) застегивание (наподобие застежки-молнии). Поскольку зацепление включает две одноцепочечные молекулы ДНК, скорость реакции пропорциональна квадрату концентрации ДНК (измеряемому по молярности нуклеотидов) и, следовательно, представляет собой реакцию второго порядка. Напротив, в застегивании принимает участие уже единая двухцепочечная молекула, и потому это реакция первого порядка, а с точки зрения механизма - мономолекулярная. Экспериментально ренатурация ДНК идет в соответствии с кинетикой реакции второго порядка. Следовательно, лимитирующей стадией является установление первых связей между одноцепочечными молекулами (зацепление).
Пусть с - концентрация одноцепочечных молекул ДНК в момент времени Г, а с0 - концентрация в начальный момент t = 0. Тогда уравнение реакции второго порядка, описывающее убывание концентрации одноцепочечной ДНК, имеет вид
где k2- постоянная скорости реакции второго порядка, или
Интегрирование этого уравнения дает
При t = 0 с = с0, следовательно, const =  Подставляя, получаем
| или
Время, за которое концентрация убывает вдвое (время полуренатурации), обозначается t 1/2. Из предыдущего уравнения
откуда
На рис. 9.2 представлен график зависимости с/с0 от c0t, он называется с0t-графиком.
Ветмур и Дэвидсон показали, что константа скорости реакции второго порядка ренатурации ДНК k2 обратно пропорциональна N- числу нуклеотидов в неповторяющихся участках нуклеотидной последовательности гаплоидного генома прокариот. Это соотношение задается формулой
где L - среднее число нуклеотидов в одноцепочечном фрагменте, β -средняя плотность точек, в которых устанавливается связь между двумя цепями, α -коэффициент. Комбинируя уравнения (3) и (4), мы видим, что величина c0t1/2 прямо пропорциональна N. (а - коэффициент пропорциональности):
Важность уравнения (5) демонстрируется рисунком 9.3, на котором представлены кривые ренатурации фрагментов ДНК, полученных из молекул ДНК различной сложности. Для молекул ДНК, для которых известны значения L и N, коэффициент пропорциональности а можно определить по
|
266 Организация и передача генетического материала
| набору значений c0t1/2, получаемых при различных условиях эксперимента (при разных температурах и ионных силах раствора). В этом состоит один из наиболее важных результатов исследования кинетики, а именно: используя один и тот же набор условий эксперимента, можно по значению а рассчитать N для ДНК неизвестной природы.
На рис. 9.4 сравниваются кривые ренатурации бактериальной ДНК и ДНК эукариотических организмов. По форме кривой видно, что ренатурация бактериальной ДНК происходит при неизменном значении константы скорости реакции второго порядка, т.е. в соответствии с уравнением (2). Напротив, кривая ренатурации ДНК эукариотического организма свидетельствует о том, что в процессе ренатурации величина k2 должна изменяться. Для того, чтобы интерпретиро-
| вать кривые ренатурации ДНК типа изображенной на рис. 9.4, следует предположить, что в ДНК эукариотических клеток присутствуют различные типы нуклеотидных последовательностей, различающихся сложностью и частотой повторов. Часть ДНК, ренатурирующая медленнее всего (т.е. характеризующаяся наиболее высокими значениями c0t1/2), отвечает уникальным последовательностям, представленным в геноме однократно. Фракции, ренатурирующие более быстро, соответствуют семействам идентичных или очень близких последовательностей, каждая из которых характеризуется определенным значением константы скорости, отражающим сложность (N) семейства. Долю генома, занятую последовательностями того или иного типа, можно оценить по ординате графика, представленного на рис. 9.4.
|
Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 602 | Нарушение авторских прав
|
