АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Методы работы с ДНК

Наследственная информация кодируется последовательностью нуклеотидов в молекуле ДНК. Любая экспериментальная методика, предназначенная для определения последовательности нуклеотидов, требует химически чистых препаратов ДНК. Слово «чистый» в данном случае означает не только отсутствие примесей других типов молекул, например РНК и белков, но и гомогенность нуклеотидных последовательностей. Все молекулы ДНК в таком образце должны быть одинаковы как по размерам, так и в отношении последовательности нуклеотидов. По этой причине первыми для изучения генетической организации на уровне нуклеотидов были выбраны вирусы прокариотических и эукариотических организмов. Геномы вирусов относительно малы, и вирусные частицы можно довольно легко отделить от клеточного материала еще до химического выделения интактных молекул ДНК из вирусных частиц. Описанное в гл. 7 гетеродуплексное картирование фага λ основано на умении генетиков выделять интактные молекулы ДНК из различных линий фага λ, геномы которых с генетической точки зрения уже изучены. То же самое относится и к исследованиям, показавшим концевую избыточность нуклеотидных последовательностей фагов Т2 и Т4 и циклические перестановки в их геномах. Напротив, огромная длина молекул ДНК бактериальных хромосом и хромосом эукариот делает эти молекулы очень уязвимыми в отношении разрывов при их выделении из клеток. Разрывы происходят случайно вдоль двойной спирали, и в результате возникает сложная смесь более мелких молекул ДНК, отличающихся друг от друга длиной и последовательностью нуклеотидов. Извлечь из такой смеси химическими методами информацию об исходной конкретной последовательности нуклеотидов в интактной хромосоме невозможно.

9. Методы работы с ДНК 261

В 1970 году Смит и Вилкокс получили чистый препарат нового типа нуклеазы из бактерии Haemophilus unfluenzae. Это событие оказалось решающим для дальнейших исследований. Выделенная ими нуклеаза расщепляла молекулы ДНК, разрывая фосфатные связи не в произвольных местах, а в определенных последовательностях нуклеотидов. Это открытие, а также создание методов клонирования относительно небольших фрагментов двухцепочечной ДНК привело к «рекомбинантной революции» в исследованиях ДНК и послужило основой современных генетических и биохимических исследований. Метод рекомбинантных ДНК решил проблему получения препаратов ДНК, содержащих молекулы одинакового размера и с одинаковой последовательностью нуклеотидов.

Прежде чем перейти к подробному рассмотрению этого метода, мы сначала познакомимся с информацией, которую можно получить при случайном расщеплении ДНК и, соответственно, при исследовании неоднородной смеси нуклеотидных последовательностей. Хотя информация, полученная такими методами, носит статистический характер, тем не менее до 1970 г. она играла важную роль в описании общих закономерностей организации последовательностей ДНК многих организмов. Эта информация была получена из теоретических и экспериментальных исследований реассоциации одноцепочечных фрагментов ДНК.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 634 | Нарушение авторских прав