АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Буферные растворы

· 0,02М фосфатный буферный раствор (ФБР), рН 7,2 (5,155 г Na₂HPO₄*12H₂O и 0,761 г KH₂PO₄ растворяют в 1 литре дистиллированной воды);

· 0,05М карбонатно-бикарбонатный буфер, рН 9,6 (0,795 г Na₂CO₃ и 1,465 г NaHCO₃ в 500 мл дистиллированной воды);

· МФБР рН 7,4 с 0,5 % твина 20 (8,0 г NaCl, 0,2 г KH₂PO₄ и 2,9 г Na₂HPO₄ и 0,8 мл твина 20 растворяют в 1 литре дистиллированной воды);

· Физиологический раствор рН 7,3 с 0,05% твина 20 (на 1 литр физиологического раствора добавляют 0,8 мл твина 20);

· Барбиталовый буфер рН 7,4
(125,5 г NaCl, 15,3 г Na‑5,5‑диэтилбарбитурата, 51,9 мл 1H раствора HCl, 1,53 г MgCl₂*6H₂O и 0,492 г CaCl₂*6H₂O растворяют в 3 литрах дистиллированной воды)

· 0,001М ацетатный буфер рН 4,3 – 4,4 (0,136 г CH₃COONa*3H₂O растворяют в 1 литре дистиллированной воды и подкисляют ледяной уксусной кислотой до указанного значения рН).

Реактивы.

· Субстрат: 5-аминосалициловая кислота (5-АС). 5-АС растворяют в горячей дистиллированной воде (70°C) в концентрации 0,8 мг/мл, охлаждают до 20-22°С и доводят рН до 6 0,1N раствором едкого натра (NaOH);

· 30%-ный раствор перекиси водорода (Н₂О₂): хранят при +4°С в склянке из темного стекла;

· Субстратная смесь: готовят непосредственно перед добавлением в лунки пластин смешиванием растворов 5-АС и 30%-ного раствора Н₂О₂ (к 20 мл 5-АС добавляют 0,020 мл 30 %-ного Н₂О₂);

· 1N раствор едкого натра (NaOH): 10г NaOH растворяют в 250 мл дистиллированной воды;

· 1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА): 1г БСА растворяют в 100 мл 0,02М ФБР, рН 7,2;

· 0,1М раствор периодата натрия (NаIO₄): 53,5 мг NаIO₄ растворяют непосредственно перед применением в 2,5 мл дистиллированной воды;

· Раствор борогидрида натрия (NaBH₄): 20 мг NaBH₄ растворяют в 5 мл дистиллированной воды.

Оборудование.

Для приготовления необходимых ингредиентов и постановки ИФА используется следующее основное оборудование:

· автоматические пипетки с регулируемым объемом модели Р-20, Р-200, Р-1000 и Р-5000 (фирма Gilson, Франция);

· автоматические пипетки с постоянным объемом модели F-10 – F-100 (фирма Gilson, Франция);

· 4-8-12 канальные автоматические пипетки с постоянным и регулируемым объемом модели 50 – 200 (фирма Flow Laboratories, Англия);

· спектрофотометр типа Titertek Multiskan (фирма Flow Laboratories, Англия);

· система для жидкостной хроматографии (фирма Pharmacia-LKB, Швеция);

· прибор для электрофореза модель GS-411 (фирма, Pharmacia-LKB, Швеция);

· холодильник, термостат, рН-метр (Россия);

· лабораторная посуда.

Твердая фаза.

Для твердофазного ИФА используется множество различных носителей, к которым сорбционно или, реже, ковалентно присоединяются соответствующие антигены и антитела. В ранних работах носителями служили частицы сефарозы, целлюлозы, биогель, [КСВ1] латекс, пористое стекло, силохромы и другие.

Наиболее широкое распространение получил метод физической адсорбции на поверхности полистирольных пластин с 96 лунками. Количество адсорбированного вещества при этом зависит от многих факторов: природы и дозы сенситина, рН, времени сенсибилизации, температуры инкубации. Удобно заранее заготовить панели с адсорбированным на них белком и хранить их в холодильнике до употребления. Можно также длительно сохранять сенсибилизированные панели при – 70°С.

На сегодняшний день широко используются полистироловые пластины зарубежных фирм (Cooke, Dynateck; Linbro; Flow и другие), ленин-градского завода «Медполимер» и производства ВНИИ медтехники.

При получении новой партии пластин необходимо проверять их сорбционную емкость. Для этого отбирают несколько и в каждую лунку вносят по 0,2 мл 5-кратных разведений нормальных бычьих иммуноглобулинов (от 10 до 1000 мкг/мл). После инкубации в течении 16 часов при температуре 20-22°С и последующего отмывания в лунки на 20 минут вносят по 0,2 мл 1%-ного раствора овальбумина. Затем пластины отмывают и добавляют рабочее разведение антивидового (антибычьего) пероксидазного конъюгата на 50 минут при 37°С. Если при данных сенсибилизирующих дозах иммуноглобулинов оптическая плотность после добавления субстрата составляет примерно 1,0, то считают, что сорбционная емкость этих пластин удовлетворительная. При этом разброс показателей параллельных образцов не должен превышать 10 %.

Фермент.

Ферменты представляют собой очень удобные метки потому, что их каталитические свойства позволяют действовать им в качестве усилителей, т. к. одна молекула фермента может способствовать образованию более 1·10⁵ молекул продукта каталитической реакции в минуту (Johuson K. et al., 1980). Выбор фермента-метки диктуется не только свойствами самого фермента и условиями опыта, но также склонностью автора, выбирающего наиболее доступный и подходящий для себя фермент.

Фермент, выбираемый для метки антител, должен соответствовать следующим нескольким требованиям:

быть относительно дешевым;

хорошо растворяться в воде;

сохранять стабильную активность;

иметь свободные реакционно-способные группы (например, –NH₂, ‑COOH, или –SH) для связывания с иммунологически активной молекулой.

Для постановки ИФА различными авторами наиболее часто исполь­зовались такие ферменты как пероксидаза, щелочная фосфатаза, ацетилхо­лин­эстераза, галактозидаза, глюкозооксидаза и другие.

Нельзя рекомендовать какой-либо один фермент; у каждого есть свои недостатки и достоинства, поэтому выбор фермента зависит не только от перечисленных выше качеств, но и конкретных целей и способов исследования.

Наиболее часто используют в ИФА пероксидазу, которая широко дос-тупна и не так дорога, как другие ферменты, стабильна при хранении. Пе-роксидаза является гликопротеидом (Мол. масса 40000), содержит 18% углеводов. Углеводная часть ее не проявляет энзиматической активности и поэтому может служить местом для прикрепления к ней белков (8 точек).

Препараты пероксидазы производят ряд зарубежных фирм (Serva, ФРГ; Fluka, Швейцария), налажен также выпуск отечественной пероксида-зы. Ферменты этих фирм, как и препарат отечественного производства, являются высокоочищенными, высокоактивными и их можно непосредственно использовать в работе.

Субстрат.

Выбор субстрата для выявления активности связанного фермента в системе «антиген-антитело» зависит от вида фермента-метки, так как реакция фермента с субстратом весьма специфична. Кроме того, желательно использовать субстраты, позволяющие проводить визуальный и инструментальный учет реакции. С этой точки зрения, наиболее подходящи, так называемые, хромогенные субстраты, растворы которых, изначально бесцветные, в процессе ферментативной реакции приобретают окраску, интенсивность которой пропорциональна количеству фермента.

Для выявления активности пероксидазы в твердофазном ИФА в качестве субстрата чаще всего используют 5-аминосалициловую кислоту, образующую интенсивное коричневое окрашивание, орто-фенилендиамин, дающий оранжево-желтое окрашивание, и ABTS, дающий окраску цвета морской волны. Для выявления активности щелочной фосфатазы и (b-галактозидазы используется исключительно нитрофенил-фосфаты и нитрофенил-галактозиды, соответственно.

Для повышения чувствительности ИФА предложен субстрат, дающий при расщеплении продукт, обладающий способностью к флюоресценции (Prouovost E et al.,1981). В этом случае, даже минимальная степень преобразования субстрата может быть зарегистрирована высокочувствительным прибором – флюориметром.

Выделение иммуноглобулинов и методы контроля их чистоты, активности и специфичности

Сыворотка, полученная от животных, помимо широкого набора антител содержит и «балластные» белки, способные адсорбироваться на твердом носителе, мешать связыванию антител и значительно снижать чувствительность и специфичность реакции. Во избежании этого исходную антисыворотку очищают с помощью 2 – 3-кратного осаждения сульфатом аммония, полиэтиленгликолем (Berqquist N. et al., 1970) или каприловой кислотой (Steiubuch W. et al.,1969) с последующим фракционированием белков гельфильтрацией (Остерман Л.,1985).

В своей повседневной работе для получения иммуноглобулинов из сыворотки кролика и крупного рогатого скота предварительно выделяли гамма-глобулиновую фракцию белка: из кроличьей антивидовой сыворотки 3-х кратным высаливанием сульфатом аммония при 35 % -ном насыщении, а из сыворотки крупного рогатого скота – 2-х кратным высаливанием при 45 %-ном насыщении.

15 – 20 мл раствора высаленных глобулинов (30-40 мг/мл) вносили в колонку (диаметр 2,6 см, длина 100 см) с Ультрогелем АсА-34 для выделения иммуноглобулинов класса G методом двукратной гельфильтрации. В качестве элюирующего раствора использовали 0,25 М раствор NaCl на 0,01М ФБР, рН 8,0, при скорости элюции 30 мл/час. Выход белка их колонки регистрировали на проточном спектрофотометре (иммуноглобулины G содержатся во фракциях второго пика, которые объединяют: концентрируют высаливанием и вновь подвергают гельфильтрации). После второго цикла гельфильтрации получали один пик белка. Полученый материал концентрировали сульфатом аммония при 50 % насыщении и диализовали против дистиллированной воды в течение 2-х суток, сменяя воду не менее 4-6 раз. Степень освобождения от ионов сульфата контролировали 10 % -ным раствором BaCl₂. Активность препаратов иммуноглобулинов из кроличьей антисыворотки проверяли в РДП (не ниже 1:64), а из специфической сыворотки крупного рогатого скота – в непрямом методе ИФА (не ниже 1:1600) чистоту фракций контролировали при помощи иммуноэлектрофореза (ИЭФ).

Техника постановки распространенных вариантов ИФА

Известно значительное число модификаций постановки ИФА в зависимости от природы определяемых веществ и целей исследования. Все методы ИФА подразделяются на две основные группы: гомогенные и гетерогенные методы ИФА. Первые характеризуются тем, что вся совокупность иммунологических и ферментативных реакций происходит в единой смеси всех используемых компонентов реакции без их разделения и удаления промежуточных продуктов и не прореагировавших компонентов. Для вторых характерно проведение анализа на твердой фазе в виде последовательных стадий, причем после каждой стадии происходит отмывка твердой фазы и, соответственно, удаление промежуточных продуктов и избытка не прореагировавших компонентов. Необходимо отметить, что гомогенные методы анализа очень сложны в отработке оптимальных условий их проведения и используются практически только для определения низкомолекулярных гормонов, метаболитов и лекарственных веществ. Гетерогенные же методы ИФА более просты и воспроизводимы и поэтому стали широко использоваться для качественного и количественного выявления высокомолекулярных веществ и получили широкое распространение в диагностике инфекционных болезней человека и животных.

Наиболее простыми и часто употребляемыми в диагностике вариантами твердофазного ИФА для определения антител и антигенов являются: непрямой метод и метод ингибирования – для выявления антител; метод «двойных» антител (сандвич) для выявления антигенов.

Рис 1. Непрямой метод

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 905 | Нарушение авторских прав