АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Основные принципы получения моноклональных антител.

В основу метода наработки МАт положена способность нормальных плазматических клеток иммунного организма сохранять продукцию антител после слияния с перевиваемыми опухолевыми клетками. В результате образуется популяция гибридных клеток (гибридом), которой родительские селезеночные клетки передали способность вырабатывать специфические антитела, а родительские миеломные – способность к неограниченному росту и индукции асцитных и солидных опухолей. В настоящее время предложено несколько модификаций метода получения гибридом, но все они сводятся в целом к проведению следующих этапов (рис.1):

· иммунизация животных;

· слияние иммунных лимфоцитов животных с миеломными клетками;

· селекция гибридных клеток;

· наращивание клонов и скрининг их на способность продуцировать специфические антитела;

· клонирование гибридом и наращивание клонов гибридом в культуре и организме сингенных мышей;

· изучение свойств полученных МАт.

Большое значение при получении гибридом придается опухолевой линии клеток – одному из партнеров, участвующему в гибридизации, – которая должна отвечать определенным требованиям. Существует ряд критериев для выбора опухолевой линии клеток в качестве партнера для слияния.

Для В-лимфоцитов таковыми являются плазмацитомы (миеломы), а для Т-лимфоцитов – Т-лимфомы.

Во-вторых, они должны легко расти в культуре in vitro, иметь время генерации около 12 часов и, по возможности, пролиферировать на минимальных питательных средах.

В-третьих, желательно, чтобы опухолевые клетки-партнеры были способны расти в брюшной полости сингенных животных, обеспечивая по этому признаку хорошую наследственность гибридным клеткам в плане получения асцитов, как источника больших количеств МАт.

В-четвертых, они должны обладать высокой гибридизуемостью, обеспечивая частоту гибридизации около 10^–2 (т.е. каждая сотая клетка из общей смеси должна давать жизнеспособный гибрид). И, наконец, опухолевые клетки должны быть мутантны по определенным генам, контролирующим экспрессию жизненно-необходимых ферментов, для того, чтобы опухолевый партнер по гибридизации наверняка погибал на специальных селективных средах и не маскировал рост гибридов.

Наиболее широко используемый метаболический дефект – отсутствие фермента гипоксантин-гуанини-фос­фо­ри­бо­зил­транс­фе­ра­за (ГГФРТ). В клетках млекопитающих существует два пути синтеза нуклеотидов – основной, при котором нуклеотиды синтезируются de novo из аминокислот и углеводов, и запасной, так называемый метаболический шунт, для которого характерно использование предшественников пуринов – гипоксантина и тимидина. Синтез нуклеотидов по второму пути может происходить лишь в том случае, когда в клетках присутствует фермент ГГФРТ. Этот фермент обеспечивает включение в ДНК и РНК и таких антиметаболитов, как 8-азагуанин или 6-тиогуанин, что приводит клетку к гибели. Поэтому, если опухолевые клетки культивировать на среде, содержащей 8-азагуанин, то смогут выжить только мутанты, у которых отсутствует функционально активная ГГФРТ. Этот простой прием широко используется для получения опухолевых клеточных линий – партнеров для гибридизации. Клетки таких линий способны расти, синтезируя свои нуклеотиды de novo из углеводов и аминокислот. Аналог фолиевой кислоты аминоптерин блокирует синтез de novo. Однако клетки, имеющие ГГФРТ и его субстраты – гипоксантин и тимидин, сохраняют жизнеспособность в присутствии аминоптерина. Поэтому гибридные клетки, вобравшие в себя геном нормального лимфоцита, содержащий нормальный ген ГГФРТ, выживают в отличие от родительских опухолевых клеток на селективной среде, содержащей гипоксантин-аминоптерин-тимидин (НАТ). Второй партнер по гибридизации – лимфоциты, как правило, в культуре не размножаются и отмирают через 7-14 дней.

В настоящее время существует множество различных типов маркированных (дефектных по ГГФРТ) миеломных линий клеток лабораторных животных (мышь, крыса) и человека. Наиболее широкое распространение получили мышиные миеломы в основном генотипа ВАLB/с (табл. 2).

Большинство из них являются субклонами давно известной миеломной линии Р3-Х63. В 1978 г. Г. Келер с сотрудниками получили несекретирующую иммуноглобулины линию NS1/1Ag4.1, а Шульман с сотрудниками из гибридного клона Sp 2/HLGK, секретирующего МАт к эритроцитам барана, получили линию Sp 2/0-Ag 14.1, обладающую повышенной гибридизуемостью и пролиферативной активностью. В 1979 году исследователями из ФРГ получена миеломная линия P3-X63-Ag8.653, ставшей одной из самых популярных в мире линий, используемых для гибридизаций. В 1983 г. сотрудниками фирмы «Nunclon» Таггортом и Сальмофом получена миелома FOX-NY. Эта линия является дефектной по двум ферментам: ГГФРТ и АФРТ (аденин-фосфорибозилтрансфераза), поэтому при слиянии со спленоцитами от Робертсоновских мышей RB (8.12), у которых активный локус тяжелой цепи IgG на 12-й хромосоме и селективный локус ферментного маркера АФРТ на восьмой генетически связаны, дальнейшая селекция может проводиться как на среде НАТ, так и на среде, содержащей азасерин, который блокирует синтез пуринов de novo в клетках, дефектных по АФРТ. Причем гибридомы, полученные селекцией по АФРТ, более стабильны и в 100% случаев являются антителопродуцентами, поскольку несекретирующие антител гибриды, погибают в селективной среде в связи с транслокацией 8 и 12 хромосом.

Правильный выбор и подготовка опухолевой линии клеток для слияния является безусловно ответственным моментом, однако подготовка иммунных лимфоцитов – второго партнера по гибридизации имеет не менее важное значение при получении МАт.

.

Миеломные линии, используемые для получения гибридом

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 569 | Нарушение авторских прав