АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Непрямой метод.

Данный вариант ИФА проводят с использованием антивидовых конъюгатов. Наиболее распространенными антивидовыми коньюгатами являются меченые ферментом антитела кролика, иммунизированного глобулинами других видов млекопитающих (например, крупного рогатого скота), меченые антитела осла, иммунизированного иммуноглобулинами кролика и т. д.

Данный подход позволяет решить проблемы серодиагностики заболеваний животных, используя ограниченный набор антивидовых иммуноферментных конъюгатов, что значительно облегчает задачу производства реагентов для ИФА.

Непрямой твердофазный метод ИФА ставили по следующей схеме (рис.1):

пластины сенсибилизировали в течение 16 – 18 часов при 20 – 22°С специфическим антигеном в концентрации 15-20 мкг/мл в 0,05М карбонатном буфере рН 9,6;

не связанные адсорбционно активные центры на полистироле пластин блокировали 1% раствором БСА на 0,02М ФБР рН 7,2 с 0,05 % твина 20 при инкубировании в течении 45 минут при 37°С;

исследуемые сыворотки в последовательных разведениях на ФБР-твин вносили в лунки, сенсибилизированные антигеном;

антивидовой конъюгат вносили в лунки в рабочем разведении 1:1000 – 1:2000 в ФБР рН 7,4 с 0,05 твина 20, инкубировали в течение 45 минут при 37°С;

вносили субстратную смесь и выдерживали пластины при 20-22°С в течение 30 минут для визуального или инструментального учета.

При постановке реакции использовали контроли:

контроль субстрата: в I-й ряд сенсибилизированной пластины вносили только субстратную смесь, в промежуточные этапы – ФБР рН с 0,05% твина 20. Субстратный контроль использовали в качестве нулевого в показаниях спектрофотометра;

контроль коньюгата: во 2-й ряд сенсибилизированной пластины вместо сыворотки вносили ФБР рН 7,4 с 0,05 % твина 20. Контроль коньюгата выявляет неспецифическое связывание коньюгата с антигеном;

положительный контроль: положительную сыворотку крови крупного рогатого скота в разведении 1:400 в ФБР рН с 0,05 % твина 20 вносили в 2 лунки 3-го ряда сенсибилизированной пластины;

отрицательный контроль: нормальную сыворотку крови крупного рогатого скота в разведении 1:400 в ФБР рН 7,4 с 0,05 % твина 20 вносили в 2 лунки 3-го ряда сенсибилизированной пластины (Барышников П.,1995).

Твердофазный «сандвич»–вариант ИФА.

Этот вариант ИФА является крайне распространенным для определения антигенов, обладающих более чем одной распознаваемой антителами детерминантой. В процессе анализа антиген как бы «зажат» между молекулами антител, что и обусловило название метода «сандвич». Это название теперь используется практически во всей литературе на правах официального термина.

Данный вариант ИФА ставили по следующей схеме (рис.2):

полистироловые пластины сенсибилизируют в течении 16-18 часов при 20-22°С иммуноглобулинами в концентрации 5-10 мкг/лунку в 0,05-0,1 М карбонатном буфере рН 9,0-9,5;

наслаивают 1% раствор БСА на 0,02М ФБР рН7,2 выдерживают в течение 45 минут при 37°С;

исследуемые пробы антигенов наслаивают в ФБР рН 7,4 с 0,05 % твина-20, выдерживают 45 минут при 37°С;

наслаивают конъюгат в рабочем разведении 1:400 в ФБР рН 7,4 с 0,05% твина 20, выдерживают 45 минут при 37°С;

вносят субстратную смесь и пластины выдерживают при 20-22°С в течение 15-20 минут для визуального и инструментального учета.

Все компоненты реакции вносят в объеме 0,2 мл. После каждого этапа пластины отмывают физиологическим раствором рН 7,3 с 0,05% твина 20. Для этого лунки заполняют этим раствором, встряхивают и выливают содержимое, затем вновь повторяют отмывание до 3-х раз.

При постановке реакции использовали контроли:

контроль субстрата: в 1-й ряд сенсибилизированной пластины вносят только субстратную смесь, в промежуточные этапы ФБР рН 7,4 с 0,05% твина 20.Субстратный контроль используется в качестве нулевого в показаниях спектрофотометра;

контроль конъюгата: во 2-й ряд сенсибилизированной пластины вместо антигена, вносят ФБР рН 7,4 с 0,05 % твина 20. Контроль конъюгата выявляет неспецифическое связывание конъюгата с сенсибилизированной пластиной;

положительный контроль: специфический антиген в ФБР рН 7,4 с 0,05% твина 20 вносят в 2 лунки 3-го ряда сенсибилизированной пластины.

Основным достоинством «сандвич» – варианта является высокая чувствительность, превышающая возможности других схем твердофазного ИФА. Эффективность образования специфического комплекса на каждой стадии анализа зависит от константы связывания реакции антиген-антитело и концентрации компонентов. При данной величине константы связывания и крайне низких концентрациях антигена рассматриваемый метод дает возможность сдвигать равновесие в сторону образования специфических комплексов за счет использования избытка иммобилизированных и меченых ферментом антител.

Рис. 2 Твердофазный «сандвич»–вариант ИФА.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 470 | Нарушение авторских прав