АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Метод моноклональных антител и его практическое использование в диагностике.

Применение метода гибридом и МАт в биологических и медицинских исследованиях вызвало взрывной рост информации и замену наших представлений о структуре вирусов и антител, функции отдельных компонентов вириона (антигена) в развитии иммунных реакций, о структуре и роли различных типов антител в нейтрализации вирусов, о механизмах нейтрализации и т. д. Неудивительно, что все больше и больше исследований проводится с использованием МАт.

За последнюю четверть двадцатого века технология получения МАт совершила молниеносный скачок от чисто теоретического направления исследований до биотехнологических компаний по их производству.

В своей лекции, посвященной присуждению Нобелевской премии, К. Мильштейн сказал, что быстрое развитие биотехнологии обусловлено использованием биологических механизмов, связанных со способностью иммунной системы генерировать около 106 – 109 различных антител, при очень небольшом количестве генов, контролирующих этот процесс.

Основные элементы стратегии и тактики
получения гибридом и МАт

Технически этот вопрос решился именно путем гибридизации В-лимфоцитов, секретирующих антитела, с перевиваемыми миеломными клетками, обладающими неограниченной потенцией роста. Соединение этих свойств в одной гибридной клетке дало биологам метод получения «биологически чистых реактивов», которые явились уникальным инструментом познания структуры и функции не только антигенов и антител, но и самих клеток, их продуцирующих.

Новый этап развития биотехнологии, связанный с внедрением гибридом и МАт, охарактеризовал себя созданием новых концепций о структуре и функциях изучаемых объектов.

Какие же новые концепции превнесены в вирусологию и иммунологию с внедрением метода МАт?

1. Метод МАт обеспечил изучение антигенной структуры микроорганизмов в нативном виде, в их естественной локализации и в их активном функциональном состоянии. Такой возможности не могли представить исследователям ни биохимические методы, ни методы молекулярной биологии, ни генной инженерии. Перечисленные методы требуют для изучения структуры компонентов биологических объектов (вириона), в частности, их локализации, предварительной обработки физическими и химическими факторами, что, как правило, приводит к различного рода повреждениям активных группировок или конформационным изменениям рецепторов. Следовательно, результаты таких взаимодействий не всегда можно контролировать, а учитываемый эффект может быть искажен. Например, при выделении полипептидов детергентами, часть полипептидов денатурирует и их нельзя выявить доступными методами. В отличие от этого, выделение полипептидов с помощью МАт, где происходит специфическое связывание антигена с антителом, последующая элюция не приводит к повреждению структуры антигена. Повреждение или изменение структуры биологических веществ наблюдали при выделении гемагглютинина вируса гриппа (в мономерной форме) при конструировании химической вакцины, в результате чего антигенная активность его снижалась на 2-3 порядка. Такое же явление исследователи наблюдали при синтезе гамма-глобулинов и интерферона.

2. Метод МАт позволил выявлять активные группы, участки на молекуле антигенов (детерминанты), взаимодействующие с антителами, а также изучить характер этих взаимодействий в количественных соотношениях, т.е. сопоставлять биологические реакции с химическими и расшифровать молекулярные механизмы этих реакций. Использование МАт, обладающих строгой эпитопной специфичностью (комплементарностью к определенному антигенному участку), дает возможность изучить тонкие структурные изменения антигенных детерминант в процессе эволюции и проводить эпитопное картирование вирусных белков. В частности, с помощью МАт на молекуле нуклеопротеина вируса гриппа А птиц (ВГП) установлено наличие трех антигенных сайтов, имеющихся у подавляющего большинства штаммов вируса гриппа А птиц (рис.2). В тоже время, антигенная детерминанта, выявляемая МАт 1С6, имеется практически у всех исследованных штаммов вируса гриппа птиц, лошадей, свиней и человека, за исключением штамма A/equin/Miami/1/63 (H3N8), тогда как антигенная детерминанта, выявляемая МАт 1F8, 5C10, 5E4 и 5F12, имеется лишь у вирусов гриппа птиц и лошадей.

Эти исследования позволили сделать предположение о реассортации антигенных детерминант между штаммами ВГП и гриппа лошадей. Данные последних лет, полученные с помощью МАт, показывают, что такого рода реас сортация может наблюдаться также между вирусами гриппа птиц и человека.

Изучение структуры антигенных детерминант повысило уровень исследований в иммунологии до молекулярного уровня. Высокая специфичность МАт, на уровне химических реактивов, позволила дифференцировать различия в структуре по отдельным аминокислотам, дала возможность вести секвенирование белкового и нуклеиновых компонентов микроорганизмов, клеток животных и далее вести отбор желаемых клонов вируса. Так с помощью МАт были секвенированы клоны вируса бешенства с высокой нейровирулентностью, идентифицированы штаммы вируса бешенства различного происхождения по зонам, выделены клоны вирусов герпеса, венесуэльского энцефаломиелита и др., обладающие высокой иммуногенностью.

3. С помощью МАт были расшифрованы механизмы защитных реакций in vitro и in vivo, что позволило создать новые концепции по функционированию и реализации защитных механизмов. Изучение вопросов по взаимодействию МАт с вирусами, определение валентности антител и роль этого феномена в вирусной нейтрализации позволило создать гипотезу многоударного механизма нейтрализации. Эта гипотеза получила в последующем экспериментальное подтверждение и тем самым была развеяна догма об одноударном механизме нейтрализации.

4. Разработка метода МАт дала совершенно новое направление в создании защитных препаратов, основанное на изучении структуры идиотипических МАт и механизмов идиотип-антиидиотип взаимодействий. При этом антиидиотипические МАт могут быть использованы в качестве иммунизирующего агента, т.е. антигена. В этом направлении уже получены положительные результаты. На модельных животных было показано, что антиидиотипические антитела, несущие «внутренние образы» антигена могут быть использованы в качестве вакцин против инфекционных агентов (Alain L., 1991, Yasmin Th., 1989, Hariharan K.,1991). Более того, антиидиотипические МАт позволили провести углубленный анализ структурно-функциональных взаимоотношений между рецепторами клеток и активными сайтами антигенов.

Примером данного направления могут служить многочисленные работы отечественных и зарубежных исследователей, в которых показано получение антиидиотипических МАт к альфа-интерферону человека. Эти антиидиотипические МАт имитировали биологические свойства альфа-интерферона человека. В частности, они обладали антивирусной активностью в отношении некоторых РНК- и ДНК-содержащих вирусов. Данные антиидиотипические МАт с «внутренним образом» альфа-интерферона, меченные флуорохромом или ферментами могут, быть использованы в качестве маркеров для индикации рецепторов на мембранах иммунокомпетентных клеток человека для альфа-интерферона.

5. Метод МАт обеспечил развитие новых направлений биотехнологии при наработке биопрепаратов различного назначения – это МАт для изготовления диагностических и защитных препаратов, киллерных и хелперных клеток определенной специфичности, клеток синтезирующих гормоны роста, вещества, стимулирующие вегетативные процессы и т. д. Особенно бурное развитие и широкое распространение получили МАт используемые для целей диагностики. В настоящее время как за рубежом, так и в нашей стране разработано множество тест-систем на основе МАт для диагностики инфекционных болезней животных и человека различной этиологии. Благодаря строгой эпитопной специфичности и высокой чувствительности МАт потеснили ранее используемые методы идентификации возбудителей на основе поликлональных антител и успешно вписались в общую схему диагностики ряда вирусных и бактериальных инфекций.

Использование МАт в серологических реакциях сделало возможным проводить дифференциацию близкородственных вирусов, в отличие от сывороточных антител, которые не всегда позволяют надежно идентифицировать возбудитель и могут обладать перекрестной реактивностью со сходными по антигенной структуре вирусами. Например, вирусы эпизоотической геморрагической болезни оленей (ЭГБО), болезни Ибараки и катаральной лихорадки овец (КЛО) антигенно родственны между собой, то антитела, вырабатываемые животными в ответ на инфицирование хотя бы одним из них, перекрестно реагируют при лабораторном тестировании с другим вирусом, даже если иммунизация проводится высоко очищенным вирусным препаратом. Следовательно, для постановки точного диагноза необходимо тщательно идентифицировать изолированный вирус. Именно МАт к различным антигенным детерминантам этих вирусов позволили решить эту проблему. Разработанная на основе МАт к антигенам вирусов ЭГБО, КЛО и болезни Ибараки диагностическая тест-система позволила дифференцировать эти близкородственные в антигенном отношении вирусы. Кроме того, высокая чувствительность метода ИФА на основе МАт сделала возможным обнаружение вируса КЛО непосредственно в крови больных животных и сократить сроки диагностических исследований. Тем самым это еще раз подтверждает необходимость применения методов на основе МАт в общей схеме диагностики вирусных болезней в качестве сигнальных экспрес-методов.

Совершенствование гибридомной технологии и достигнутые успехи в получении продуктов моноклонов в настоящее время привели к созданию нового вида гибридом, названных квадромами, которые секретируют биспецифические МАт (би-МАт), которые оказались весьма перспективными для использования в различных областях иммунохимии, иммунодиагностики и иммунотерапии. Квадромы, полученные путем слияния клеток линий двух гибридом с продукцией моноспецифических MАт к различным антигенным детерминантам, синтезируют иммуноглобулиновые молекулы с двумя активными центрами, направленными к разным антигенам (биспецифические МАт) (рис 3.).

На современном этапе развития иммунологии и онкологии всесторонне изучаются возможности использования би-МАт в качестве эффективного инструмента в противоопухолевой иммунотерапии.

В настоящее время большое внимание уделяется изучению механизмов клеточной цитотоксичности и разработке на основе этих исследований подходов к лечению больных злокачественными новообразованиями и вирусными инфекциями.

В ряде экспериментальных работ показано практическое применение би-МАт в диагностике и терапии различного рода патологий человека и живот

Рис.6 Схема применения би-МАт в ИФА для одноэтапного
выявления антигена.

Таким образом, успехи, достигнутые гибридомной технологией, наглядно свидетельствуют о том, что применение МАт позволило выйти на качественно новый уровень исследований в области ветеринарной медицины и вирусологии. Моноклональные антитела на сегодняшний день представляют собой мощный инструмент для изучения антигенных взаимоотношений, при изучении взаимодействия вирусов с клетками, вопросов иммуногенеза и механизма защитных реакций, а также эффективный инструмент для изготовления диагностических и защитных препаратов, отличающихся высокой чувствительностью, специфичностью и технологичностью.

ЗАНЯТИЕ 24. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ АНТИТЕЛ \ ИММУНОБЛОТИНГ\

В настоящее время электрофорез является одним из основных методов изучения белков. Электрофорез препаратов очищенных вирионов позволил опреде­лить их белковый и полипептидный состав. В сочетании с обра­боткой детергентами и другими химическими веществами изучается структурная организация вирионов. Стало возмож­ным эффективно контролировать процессы очистки вирусов или отдельных вирусспецифических антигенов, изучать динамику и кинетику синтеза полипептидов, механизмы действия ингиби­торов, различных антивирусных соединений, молекулярные фенотипы мутантов и вариантов.

Применение радиомаркированных предшественников глико-, сульфо- фосфопротеинов, жирных кислот позволяет идентифицировать интересующие группы белков. В совокупности с методом иммунопреципитации определяются вирусспецифические белки в зараженных клетках, те из них, которые экспрессируются на мембранах; устанавливается специфичность моноклональных антител, вирусспецифических белков, синтезируемых генноинженерными или химическими способами; контролируется иммунный ответ животных на различные антигенные препараты.

Для определения полипептидной специфичности антител используют методы радиоиммунопреципитации или иммуноблотинга. При этом следует учитывать, что радиоиммунопреципитацией выявляются антитела к конформационным и линейным детерминантам нативных белков, тогда как иммуноблотингом - только к линейным детерминантам полипептидов.

Для разделения полипептидов используют метод диск-электрофореза в присутствии ионного детергента ДСН по Laemmli. При диск-электрофорезе используются буферы с различ­ными рН, что создает прерывистые градиенты электрического потенциала и рН. Система включает крупнопористый концент­рирующий гель с низким рН, расположенный над мелкопористым разделяющим гелем с высоким рН. Полипептиды быстро проходят через крупнопористый гель и концентрируются на поверхности разделяющего геля. Это позволяет получить хорошее разделение при использовании относительно больших объемов разведенных белковых растворов. Под действием ДСН в сочетании с восстановителем (2-меркаптоэтанол) и прогревом при 100 °С все белки денатурируются и разде­ляются на отдельные полипептидные цепи. Так как при элек­трофорезе в ПААГ с ДСН свободная подвижность комплексов белок - ДСН почти постоянна, моле­кулярные размеры таких комплексов можно определять по графику зависимости относительной подвижности от логариф­ма молекулярной массы.

Регистрацию полос белков, маркированных ¹⁴С, ³⁵S, ¹²⁵I, осу­ществляют методом авторадиографии, а ³Н - флюорографии. Перед авторадиографией белков, меченных ¹⁴С и ³⁵S; для исклю­чения потерь энергии b-частиц при контакте с фотопленкой гели высушивают. Для регистрации тритированных полипептидов флюорографией в гель вводят сцинтиллятор, свечение которого под действием радиоактивно меченного продукта регистрируется как и при авторадиографии наложенной на высушенный гель рентгеновской фотопленкой.

В качестве примера предлагаются методики определения спектров полипептидной специфичности антител в сыворотках вакцинированных собак.

Методика

Приготовление радиоактивно меченых белков. Двухсуточнуюкультуру клеток CV-1, выращенную в клинских матрасах, заражают ВЧС, штамм ВНИИВВиМ-88, с множественностью 0.01 ТЦД₅₀/клетка. Через двое суток культивирования вносят ¹⁴С-уксуснокислый натрий в конечной концентрации 2.5 МБк/см³. Через 4 суток после инфицирования в момент развития синцитиев клетки механически снимают с монослоя и дважды отмывают ФБР, осаждая при 1500 g в течение 20 мин. После однократного замораживания-оттаивания клетки лизируют 1% тритоном Х-100 в 0.02 М трис-НСl буфере с рН 7.4 в 1:100 от исходного объема. Лизат центрифугируют при 50 000 g 20 мин и хранят при минус 70 °C.

Иммунопреципитацию проводят следующим образом. По 0.1 см³ протеин А-сефарозы, уравновешенной в лизирующем буфере с добавлением 1мМ фенилметилсульфонилфторида, инкубируют с 0.2 см³ исследуемых сывороток собак в течение 2 ч при (20-25) °С. Затем шестикратно отмывают лизирующим буфером, и инкубируют с (0.1-0.2) см³ радиоактивно меченого антигена в течение 18 ч при 4 °С. После шестикратной отмывки сорбент суспендируют в 0.2 см³ буфера для электрофореза, кипяят на водяной бане 5 мин и элюированные полипептиды электрофоретически разделяют в 10% ПААГ.

Электрофорез. Готовят растворы: 30% Т, 2.7% С (58.4 г акриламида + 1.6 г N,N'- метилен

-бис-акриламида + Н₂О до 200 см³); четырехкратный буфер разделяющего геля - 1.5 М Трис-НСl c рН 8.8 (36.3 г Трис + Н₂О до 200 см³, рН доводят соляной кислотой); четырехкратный буфер концентрирующего геля - 0.5 М Трис-НCl c рН 6.8 (3.0 г Трис + Н₂О до 50 см³, рН доводят соляной кислотой); 10%-ный раствор ДСН (50 г ДСН + Н₂О до 500 см³); инициатор - 10%-ный раствор персульфата аммония (0.1 г персульфата аммония + Н₂О до 1 см³); N,N,N^',N'-тетраметилендиамин (ТЕМЭД); промывочный раствор разделяющего геля - 0.375 М Трис-НCl c рН 8.8 + 0.1% ДСН (25 см³ 1.5 М Трис-НCl + 1 мл 10%-ного раствора ДСН + Н₂О до 100 мл); двукратный буфер для проб - 0.125 М Трис-НСl c рН 6.8 + 4% ДСН + 20% глицерина + 10% 2-меркаптоэтанола (2.5 см³ 1.5 М раствора Трис-НСl с рН 8.8 + 4.0 см³ 10%-ного раствора ДСН + 2.0 см³ глицерина + 1.0 мл 2-меркаптоэтанола + 0.04 см³ бромфенолового синего + Н₂О до 10 см³); электродный буфер - 0.025 М Трис c рН 8.3 + 0.192 М гли­цина + 0.1%-ный ДСН (12 г Трис + 57.6 г глицина + 40 см³ 10%-ного раствора ДСН + Н₂О до 4.0 дм³); изобутанол; фиксирующий рас­твор - 12.5%-ный раствор трихлоруксусной (ТХУ) кислоты (125 г ТХУ + Н₂О до 1,0 дм³).

Компоненты для разных гелей

Концентрирующий (4% Т, 2.7%С) и разделяющий (10% Т, 2.7% С) гели готовят по данным таблицы 4. Для приготовления разделяющего геля смешивают указан­ные количества растворов мономеров, буфера, ДСН, воды, инициатора, смесь деаэрируют в колбе Бунзена, присоединен­ной к вакуумному насосу, добавляют 0.05 см³ ТЕМЭД. Смесь заливают между стеклами для формирования пластин геля. Сверху наслаивают 1 см³ изобутанола. Через 30-40 мин (после оконча­ния процесса полимеризации) изобутанол сливают и трижды промывают край разделяющего геля промывочным раствором. Остатки раствора удаляют полосками фильтровальной бумаги. Концентрирующий гель готовят аналогичным образом, на­слаивают на разделяющий гель между стеклами и вставляют шаблон в виде "гребешка". После завершения полимеризации (30-40 мин) шаблон вынимают, а камеру помещают в аппарат электрофореза.

Исследуемые образцы вносят в "карманы". Электроды соединяют с источни­ком тока, анод подключают к нижнему резервуару с электрод­ным буфером, катод - к верхнему. Электрофорез проводят при постоянном токе (20-30 мА на гель размером 12х19х0.2 см) до тех пор, пока свидетель - бромфеноловый синий не дойдет до нижней границы геля (3-4 ч).

Получение радиоавтографов. Гели с разделенными полипептидами для высушивания переносят на смоченную водой фильтровальную бумагу, укла­дывают бумажным слоем на пористую пластинку и помещают в аппарат для сушки. В случае отсутствия последнего пористую пластинку с гелем укладывают на перфорированную металли­ческую пластинку, помещают в полиэтиленовый мешок и при­соединяют к вакуумному насосу. При подогревании под лампой гель высыхает за 6-8 ч. Пластинка геля становится тонкой, твердеет и в виде гладкой пленки остается на бумаге.

Более простой способ высушивания геля состоит в следую­щем. Гель на стеклянной пластинке плотно покрывают целло­фаном, края которого фиксируют, заливая агаром или парафи­ном, и оставляют на несколько суток при комнатной температу­ре. Высушенные пластины геля хранят под прессом для пред­отвращения скручивания и другой деформации.

Для получения радиоавтографов на гелевую пластинку накладывают медицинскую рентгеновскую пленку, помещают между двумя стеклянными пластинками и фиксируют зажима­ми. Экспонируют при комнатной температуре в течение срока, определяемого опытным путем. Полипептиды, радиоактив­ность которых в смеси составляет (20-50)х10³ имп/мин, надежно регистрируются за 24-48 ч. После этого пленку проявляют 6-8 мин и закрепляют 5-10 мин в соответствующих растворах.

Для флюорографии гель перед высушиванием фиксируют в 12.5%-ном растворе ТХУ при комнатной температуре 30 мин. Наиболее простой и экономичный способ флюорографии состоит в использовании в качестве сцинтиллятора салицилата натрия, преимущество которого в его водорастворимости. Гель вымачи­вают в 10 объемах 1 М водного раствора салицилата натрия в течение 30-60 мин при комнатной температуре. В качестве сцинтиллятора применяют также дифенилоксазол. Для импрегнирования этим сцинтиллятором гель вымачивают в течение 1.5 ч в двух сменах ледяной уксусной кислоты, помещают на 1.5 ч в 3-4 объема 20%-ного дифенилоксазола в уксусной кислоте, затем промывают водой. Гель при этом становится белым и непрозрачным. После высушивания гелевую пластинку экспонируют с рентгеновской пленкой при минус 70 °С.

Рентгеновскую фотопленку РТ-1 или РТ-2 проявляют в (2.5 г метола + 72.0 г сульфита натрия безводного + 8.8 г гидрохинона + 48.0 г натрия углекислого безводного + 4.0 г калия бромистого + Н₂О до 1.0 л); фиксируют в (260.0 г тиосульфата натрия + 50.0 г хлористого аммония + 17.0 г метабисульфита натрия + Н₂О до 1.0 л). Учет результатов проводят визуально, регистрируя темные полосы на треках электрофореграмм.

Иммуноблотинг. Образцы белков зараженных ВЧС клеток готовят аналогично радиоактивно меченым белкам, но без внесения радиомаркированных предшественников. 2 мг/см³ белков в растворе буферов с низкой молярностью (0.01-0.02 М) и нейтральным рН смешива­ют с буфером для проб в соотношении 1:1 и инкубируют в кипя­щей бане 2-5 мин. Электрофоретическое разделение полипептидов проводят как описано выше. Электроперенос полипептидов из полиакрилам геля на нитроцеллюлозную мембрану осуществляют по методу Kyhse-Anderson. Сборку транс-единицы выполняют в аппарате для электропереноса, в котором графитные электроды фиксируют в пластмассовых рамках, по схеме, представленной на рис.4. Размеры листков из фильтровальной бумаги делают на 2-3 мм меньше размеров геля. В процессе сборки транс-единицы тщательно удаляют воздушные пузырьки между слоями. Электроперенос осуществляют при 0.8 mA/см² в течение 40-60 мин при 20 ^ОС. Качество переноса и его завершенность каждый раз контролируют путем окрашивания полоски НЦМ с 1-2 треками с маркерами молекулярной массы 0.5.% амидочерным.

Иммуноблотинг осуществляют следующим образом. Свободные после электропереноса полипептидов места связывания на НЦМ забивают 5% бычьим сывороточным альбумином на отмывочном буфере (0.02 М трис-НСl, рН 7.2-7.4, 0.05 % твин-20, 0.15 М NaCl), затем НЦМ инкубируют 2 ч при 37 °С с соответствующей антисывороткой в разведении 1:20-1:30, шестикратно ополаскивают в отмывочном буфере и заливают рабочим разведением конъюгата протеина А с пероксидазой хрена в отмывочном буфере. Через 2 ч НЦМ шестикратно отмывают и инкубируют с раствором субстрата (10 мг о-дианизидина, 0.07 см³ 30% Н₂О₂ в 40 мл 0.05 М трис-НСl с рН 7.2). Учет результатов проводят визуально, регистрируя темные полосы на треках электрофореграмм.

В том случае, если исследуемые образцы характеризуются низкой концентрацией белка, перед электрофорезом их необходимо концентрировать. Для этого применяют лиофилизацию, вакуумный диализ, диализ против высокомолекулярного гидрофильного материала (сефадекс G-100, G-200, декстран Т70), осаждение 10%-ной трихлоруксусной кислотой, ацетоном, сульфатом аммония.

1

2

А

В

C

D

E

3

1

Рис.7. Сборка транс-единицы в аппарате для электропереноса. (1) Графитовые электроды ((+ и -) фиксированные на пластиковой основе); (2) - шесть слоев фильтровальной бумаги, пропитанной в 0.040 М e-амино-n-капроновой кислоте/0.025 М трис/20% (объем/объем) метаноле, рН 9.4; (3) - шесть слоев фильтровальной бумаги, пропитанной в 0.3 М трис/20% (объем/объем) метаноле, рН10.4. Транс-единица: (А) - диализная мембрана; (В) - три слоя фильтровальной бумаги, пропитанных в 0.040 М 6 e-амно-n-капроновой кислоте/0.025 М трис/20% (объем/объем) метаноле, рН9.4; (С) - полиакриламидный гель; (D) - нитроцеллюлозная мембрана; (Е) - три слоя фильтровальной бумаги, пропитанных в 0.025 М трис/20% (объем/объем) метанола, рН 10.4.

Занятие 25. Полимеразная цепная реакция, её возможности в диагностике инфекций.

(Материал подготовлен совместно с д б н, профессором,

зав лабораторие ВГНКИ Обуховым И.Л.)