АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Методы иммунизации при получении гибридом.

Иммунизацию при получении гибридом проводят с целью выработки у животного – донора спленоцитов, увеличивающейся популяции В-лимфоцитов, продуцирующих антигенспецифичные иммуноглобулины. При этом В-лимфоциты, как один из партнеров для получения гибридом, должны быть способны к слиянию с плазмацитомными клетками и находиться в стадии неполной дифференциировки в зрелые плазматические клетки. Поэтому все процедуры гибридизации предусматривают взятие лимфоцитов у иммунизированного животного в первые шесть дней после введения последней дозы антигена. Лимфоциты многих видов животных способны при слиянии с клетками мышиной миеломы образуют жизнеспособные антителосекретирующие гибридомы, однако использование в качестве источника лимфоцитов мышей линии ВАLb/с открывает гораздо большие перспективы, так как гибридомы «мышь-мышь» более стабильны и секретируют больше антител, чем межвидовые гибриды. Кроме того, мышиные миеломные линии, используемые в качестве партнера при слиянии, несут антигены гистосовместимости BALb/с. Образующиеся в результате слияния с мышиными спленоцитами гибридомы при этом имеют только BALb/c – антигены гистосовместимости, что позволяет выращивать их в брюшной полости мышей этой линии. При этом продукция антител гибридомами превышает продукцию in vitro более, чем в 1000 раз.

Для иммунизации мышей необязательно использовать высокоочищенные антигены, поскольку каждая полученная гибридома будет продуцировать антитела лишь к одной антигенной детерминанте (эпитопу). В принципе возможно получение специфических гибридом и без иммунизации: получив несколько сотен гибридов из лимфоцитов интактной мыши, почти наверняка можно обнаружить хотя бы одну гибридому, МАт которой будут связываться с определенным произвольно взятым антигеном. Однако, при таком подходе эффективность гибридизации (процент гибридом, продуцирующих специфические антитела, от общего числа гибридом) – минимальна. С другой стороны показано, что обычные схемы гипериммунизаций, принятые для получения сывороточных иммуноглобулинов, не всегда оптимальны для получения высокой специфической эффективности гибридизации.

Существует два основных способа иммунизации при получении гибридом: иммунизация in vivo и иммунизация in vitro. Удовлетворительной считается средняя специфическая эффективность гибридизации, равная 10-15%. Она достигается, например, всего при двукратном введении животным небольших доз белковых антигенов в сопровождении адъюванта Фрейнда с интервалом, превышающим время прохождения пика первичного ответа. Многие исследователи при получении гибридом применяют различные схемы иммунизации, пытаясь повысить количество клеток, образующих антитела и увеличить, в конечном итоге, выход антигенспецифичных гибридом. Обычно это делают, иммунизируя ряд животных и выбирая клетки селезенки тех мышей, у которых самый высокий титр антител. Однако, не смотря на повышение уровня антител в сыворотках крови иммунизированных мышей, не всегда удается существенно повысить эффективность гибридизации. Помимо повышения активности сывороточных антител, предлагаемые методы иммунизации должны давать и хороший абсолютный выход соответствующей селезеночной популяции.

В качестве иммуногенов при получении гибридом к вирусным антигенам обычно используют лизаты зараженных клеток, нативные препараты очищенного вируса, высокоочищенный вирус, обработанный детергентами или ультрафиолетом, а также вирусные белки, химически модифицированные и синтетические полипептиды.

В последнее время стали интенсивно разрабатываться методы иммунизации in vitro. Особое значение придается иммунизации in vitro в целях получения гибридом на основе лимфоцитов человека, в силу императивного запрета на иммунизацию in vivo. На сегодняшний день опубликован целый ряд работ, в которых достаточно подробно описаны методические подходы по иммунизации спленоцитов in vitro и получению на их основе гибридом. Анализ данных по иммунизации спленоцитов in vitro показывает, что данный метод имеет ряд преимуществ по сравнению с иммунизацией мышей in vivo. Это, во-первых, сокращение сроков иммунизации до четырех – пяти суток. Во-вторых, непосредственный контакт антигена с иммунокомпетентными клетками, минуя все барьеры живого организма, что имеет большое значение для слабых иммуногенов. В-третьих, метод дает возможность контролировать эффективность иммунного ответа. Однако, несмотря на преимущества, иммунизация in vitro имеет ряд недостатков технического плана, которые сдерживают широкое внедрение этого метода в практику. В частности, нужна качественная культуральная среда и посуда, необходимо добавление в культуральную среду биологически активных иммунофакторов, а также необходима стерильность используемого антигена. Поэтому, многие исследователи изыскивают другие методы введения антигена, которые позволяют сократить сроки иммунизации, не снижая при этом выход гибридом заданной специфичности. В этом плане заслуживает внимание внутриселезеночная инъекция антигена, разработанная Spitz M. et al., а затем взятая на вооружение и другими исследователями, которые с успехом применили ее при получении МАт к различным вирусным антигенам. Внутриселезеночная иммунизация не снижает выход вирусспецифических клонов по сравнению с традиционными методами иммунизации, но, как правило, наблюдается образование гибридом, секретирующих МАт к поверхностным антигенам. Тем не менее внутриселезеночная иммунизация не всегда дает высокую эффективность гибридизации и, кроме того, возникает вопрос о стабильности антителопродукции гибридными клетками. Следовательно, при целенаправленном получении МАт к определенному белку необходимо отдавать предпочтение той иммунизации, которая способствовала бы оптимальному выходу нужных клонов.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 568 | Нарушение авторских прав