Использование неорганического фосфата в процессе брожения
Процессы диссимиляции углеводов в растительных организмах, микроорганизмах, а также в организмах животных и человека как в анаэробных, так и в аэробных условиях протекают с участием неорганического фосфата.
Молекула фосфорной кислоты включается на стадии окисления 3 –фосфоглицеринового альдегида в 1,3–дифосфоглицериновую кислоту при участии НАД+ зависимой глицеральдегидфосфатдегидрогеназы.
О
|
|
|
| О
|
| / /
|
|
|
| / /
|
| С¾ Н
| +
|
| глицеральдегид-
| С¾О ~ (Р)
| +
| ½
| + НАД
| + Н3РО4
| ¾¾¾¾¾¾¾>
| ½ +
| НАДН+Н
| Н¾С¾ОН
|
|
| фосфатдегидро-
| Н¾С¾ОН
|
| ½
|
|
| геназа
| ½
|
| СН2 ¾О(Р)
|
|
|
| СН2 ¾О(Р)
|
| 3- фосфоглицериновый 1,3 - дифосфоглицериновая
альдегид кислота
1,3–дифосфоглицериновая кислота представляет собой высокоэнергетическое соединение (макроэргическая связь условно обозначена значком ~ “тильда”). Далее происходит передача богатого энергией фосфатного остатка на АДФ с образованием АТФ и 3 - фосфоглицериновой кислоты:
О
|
|
|
| О
|
| / /
|
|
| +2
| / /
|
| С¾ О ~ (Р)
|
|
| Мg
| С ¾ ОН
|
| ½
| + АДФ
|
| ¾¾¾¾¾¾¾>
| ½ + АТФ
|
| Н¾С¾ ОН
½
СН2 ¾О-(Р)
|
|
| <¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾
фосфоглицераткиназа
| Н¾С¾ОН
½
СН2¾О-(Р)
|
| 1,3 - дифосфоглицериновая 3 - фосфоглицериновая
кислота кислота
АТФ участвует в фосфорилировании углеводов - в образовании метаболически активных форм сахаров - их фосфорных эфиров, например, из глюкозы путем фосфорилирования образуется глюкозо–6–фосфат под действием фермента гексокиназы:
Мg2+
АТФ + L-D-глюкоза ¾¾¾¾¾> АДФ + L-D-глюкоза- 6 - фосфат
гексокиназа
Глюкозо–6–фосфат превращается во фруктозо–6–фосфат под действием фермента фосфоглюкоизомеразы. Далее фруктозо–6–фосфат фосфорилируется при участии еще одной молекулы АТФ и фермента фосфофруктокиназы во фруктозо–1,6–дифосфат.
Принцип метода. Если в начале брожения и в процессе взять одинаковые пробы и проделать качественную реакцию (молибденовую) на фосфорную кислоту, то окажется,что интенсивность образующейся синей окраски в пробах убывает от первой к последней. Это обусловлено тем, что неорганический фосфат постепенно поглощается и количество его в среде уменьшается.
Количество же связанного фосфата в органической форме (АТФ, глюкозо–6–фосфат, фруктозо–6–фосфат и др.) увеличивается. Если пробы подвергнуть гидролизу, то органические соединения фосфора разрушаются и количество неорганического фосфата во всех пробирках будет равно начальной величине – окраска в пробирках будет одинаковой.
Химизм молибденовой реакции на фосфорную кислоту заключается в образовании комплексного соединения 12 молибдофосфата аммония (осадок желтого цвета), которое при добавлении аскорбиновой кислоты восстанавливается с образованием молибденовой сини (смесь окислов молибдена).
Молибденовая реакция на фосфорную кислоту:
РО4–3+ 3 NH4++ 12 МоО4–2 + 24 Н+¾® (NH4)3РО4 . 12 МоО3 + 12 Н2О
Ход работы. В четыре пронумерованные пробирки наливают по 1 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). В ступке растирают 1 г отмытых и отделенных на воронке Бюхнера дрожжей с 1 г глюкозы или сахарозы и 5 мл дистиллированной воды. К смеси добавляют 5 мл раствора фосфорнокислых солей, перемешивают и 1 мл смеси переносят в первую пробирку с ТХУ. При этом осаждаются белки, инактивируются ферменты и прекращается брожение.
Оставшуюся смесь переносят в высокий стаканчик и помещают в термостат при 37 °С на 1,5 часа. Через каждые 0,5 часа от начала брожения отбирают из стаканчика по 1 мл бродящей смеси в три пробирки с ТХУ. Через 5 минут после взятия последней пробы содержимое пробирок фильтруют через складчатые фильтры в 4 пронумерованные колбочки и получают безбелковые фильтраты.
В четыре чистые пробирки отбирают по 0,5 мл безбелкового фильтрата из колбочек и проводят молибденовую реакцию на фосфорную кислоту. Для этого в каждую пробирку вносят по 0,1 мл 2,5 % – ного раствора молибденовокислого аммония в серной кислоте и 0,5 мл 0,5 %–ного раствора аскорбиновой кислоты, перемешивают и оставляют на 15 минут. Затем в каждую пробирку добавляют по 8 мл дистиллированной воды, перемешивают и сравнивают окраску жидкости во всех пробирках. Интенсивность окраски должна уменьшаться от первой к четвертой пробирке, так как неорганический фосфат в процессе брожения убывает.
Для гидролиза образовавшихся органических соединений фосфора в четыре пронумерованные пробирки (второй ряд) вносят из колбочек по 0,5 мл безбелкового фильтрата и добавляют по 0,5 мл 2 н. раствора соляной кислоты и ставят в кипящую водяную баню на 8–10 минут. По окончании гидролиза во всех пробирках проделывают молибденовую реакцию.
Результаты работы заносят в таблицу 1, изображая интенсивность окраски знаками +1; +2; +3; +4.
Таблица 1 – Интенсивность окраски молибденовой реакции
Дата добавления: 2015-08-06 | Просмотры: 873 | Нарушение авторских прав
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 |
|