АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Качественное определение активности сукцинатдегидрогеназы

Прочитайте:
  1. C. повышение цитотоксической активности Т-лимфоцитов
  2. C16. Злокачественное новообразование желудка
  3. E. повышение ферментативной активности лизосом
  4. E. снижения активности фермента глутатионпероксидазы
  5. I. Определение верхушечного толчка.
  6. I.1. Определение понятия
  7. II) Энзимологическое определение количества метаболитов.
  8. III. Виды реактивности
  9. IV. Роль реактивности организма в возникновении и развитии опухолевого процесса.
  10. IV.1. Дыхательная недостаточность. Определение понятия

Сукцинатдегидрогеназа (1.3.99.1.) катализирует окисление сукцината до фумарата. Кофактором фермента является ФАД - флавинадениндинуклеотид.

Реакция, катализируемая сукцинатдегидрогеназой, характеризуется абсолютной стереоспецифичностью элиминирования водорода, так что отщепляются исключительно атомы водорода в транс - положении. Если бы подобная специфичность не существовала, образовалась бы смесь (50:50) двух изомерных ненасыщенных дикарбоновых кислот; малеиновой (цис) и фумаровой (транс). Однако образуется только фумаровая кислота:

FАD FАDН2

Н Н   НООС Н Н Н
½ ½ сукцинат- \ / ½ ½
НООС ¾С¾С¾СООН ¾¾¾¾> С= С + С = С
½ ½ <¾¾¾¾ / \ ½ ½
Н Н дегидроге наза Н СООН НООС СООН
        фумаровая к-та малеинова к-та
        (транс) (цис)
        образуется не образуется

é Цис и транс изомеры получились бы совместно,ù

ë если реакцияидет неспецифична û

Среди ферментов цикла лимоннонной кислоты сукцинатдегидрогеназа занимает особое место, поскольку локализована в митохондриальной мембране:

    О         ОН
    ||         |
    С         С
  / \       // \
  СI¾С С¾СI       СI¾С С¾СI
  || ||       | ||
  Н¾ С С¾Н       Н¾ С С¾Н
  \ /       \\ /
СООН   С     СООН   С
½   || сукцинатдегидро- ½   |
СН2 + N ¾¾¾¾¾¾¾> СН + N¾ Н
½   ½ геназа (скелетной ||   ½
СН2   С мышцы) СН   С
½ // \     ½ // \
СООН Н¾ С С¾ Н     СООН Н¾ С С¾ Н
  | ||       | ||
  Н¾ С С¾Н       Н¾ С С¾Н
  \\ /       \\ /
    С         С
    |         |
янтарная ОNа     фумаровая ОNа
кислота       кислота  
                 

окисленная форма восстановленная форма

(синий цвет) (бесцветная)

 

Принцип метода. В условиях опыта в качестве акцептора водорода при окислении сукцината используется 2,6 - дихлорфенолиндофенол, его натриевая соль.

В водном растворе окисленная форма 2,6 - дихлорфенолиндофенола окрашена в синий цвет. Восстановленная форма этого соединения - бесцветна. Активность сукцинатдегидрогеназы мышц обнаруживают, добавляя к мышечной кашице растворы янтарной кислоты и натриевой соли окисленной формы 2,6 - дихлорфенолиндофенола. Если сукцинатдегидрогеназа активна, интенсивность синей окраски ослабевается, благодаря бесцветной форме 2,6 - дихлорфенолиндофенола.

Ход работы. В две пробирки отмеривают по 3 мл фосфатного буфера с рН 7,4. В одну пробирку(опытную) добавляют 5 капель 5 %- ного раствора янтарной кислоты и (для нейтрализации) 5 капель 0,1 н. раствора едкого натра, в другую (контрольную) приливают 10 капель дистиллированной воды. В обе пробирки добавляют по 1 мл 0,001 н. раствора 2,6 - дихлорфенолиндофенола и по 50 мг хорошо измельченной мышечной ткани (свежей). Обе пробирки помещают на 20 мин. в термостат при 37 0С. Сравнивают интенсивность окрашивания в контрольной и опытной пробирках. Делают выводы и оформляют таблицу 2.

 

Таблица 2 - Основные параметры опыта и его результаты

№ опыта Субстрат Фермент Тип катализируемой реакции Условия проведения опыта (toС, рН, добавление др. реагентов) Наблюдения
           

 

Материалы и реактивы: экстракт мышечной ткани (см. Приложение В, п.3); фосфатный буфер, рН 7,4 (см. Приложение В, п.4); 5 % - ный раствор янтарной кислоты; 0,1 н. раствор NаОН; 0,001 н. раствор 2,6 - дихлорфенолиндофенола.

Оборудование: пробирки; пипетки; термостат.

 

Дата добавления: 2015-08-06 | Просмотры: 806 | Нарушение авторских прав


1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 |

При использовании материала ссылка на сайт medlec.org обязательна! (0.004 сек.)