АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

И пероксидазы по Михлину и Броневицкой

Принцип метода определения активности о –дифенолоксидазы и пероксидазы основан на вторичном окислении аскорбиновой кислоты хинонами, образующимися из пирокатехина под действием ферментов. Избыток неокисленной кислоты оттитровывают йодом:

Н ½

Н ½

С // \

С // \

Н¾ С С ¾ ОН ½ || + 1/2 О 2

полифенолоксидаза ¾¾¾¾¾¾¾¾>

Н¾ С С = О ½ | + Н2О

Н¾ С С ¾ ОН \\/ С

Н¾ С С = О \\/ С

½ Н

½ Н

пирокатехин

о-хинон

О= С ¾¾

Н

Н

О= С ¾¾

½

½

½

½

НО¾С

С

С

О = С

|| О

//\

//\

½ О

НО¾С +

Н¾ С С = О

Н¾ С С¾ ОН

О = С

½

½ ½

¾¾>

½ ||

+

½

Н¾С¾¾

Н¾ С С = О

Н¾ С С ¾ ОН

Н ¾ С ¾¾

½

\\ /

\\ /

½

НО¾С¾Н

С

С

НО¾С¾Н

½

½

½

½

СН2ОН

Н

Н

СН2ОН

аскорбиновая о - хинон пирокатехин дегидроаскорбиновая кислота кислота

О=С ¾¾

О= С ¾¾

½

½

НО¾С

НО¾С¾ J

|| О

½ О

НО¾С +

J2

¾¾>

НО¾С¾ J

½

½

Н¾С¾¾

Н¾С¾¾

½

½

НО¾С¾Н

НО¾С¾Н

½

½

СН2ОН

СН2ОН

неокисленная a,b дииод- аскорбиновая кислота аскорбиновая кислота

Ход работы. Получение ферментной вытяжки.

3 г. испытуемого материала растирают в ступке с 20 мл 0,3 М ацетатного буфера с рН 4,7, переносят в колбу и оставляют на 30 минут для настаивания при комнатной температуре. После настаивания вытяжку центрифугируют.

Определение активности о–дифенолоксидазы (Е₀). К 1 мл центрифугата (ферментная вытяжка) добавляют 3 мл дистиллированной воды, 2 мл 0,1 %–ного раствора аскорбиновой кислоты и 1 мл 0,02 М раствора пирокатехина. Смесь встряхивают 2 минуты, добавляют 1 мл 10 %–ного раствора фосфорной кислоты и титруют из микробюретки 0,01 н раствором йода в присутствии нескольких капель крахмала. Параллельно проводят контрольное определение с прокипяченной вытяжкой (1 мл вытяжки и 3 мл дистиллированной воды кипятят 1 минуту, затем добавляют 1 мл воды взамен испарившейся при кипячении, и все необходимые реактивы, как и в случае с опытной пробой).

Активность выражают в мл 0,01 н раствора йода на 1 г испытуемого материала по разности контрольной и опытной пробы.

Определение суммарной активности о –дифенолоксидазы и пероксидазы в присутствии перекиси водорода (Е_о+n).

К 1 мл центрифугата добавляют 3 мл дистиллированной воды,1 мл 0,4%–ного раствора перекиси водорода, 2 мл 0,1%–ного раствора аскорбиновой кислоты и 1 мл 0,02 М раствора пирокатехина. (Все растворы и вода должны иметь температуру 18–20 °С). Смесь встряхивают 2 минуты, добавляют 1 мл 10%–ного раствора фосфорной кислоты и титруют из микробюретки 0,01 н раствором йода в присутствии крахмала.

Активность пероксидазы (Еn) определяют по разности суммарной активности о–дифенолоксидазы и пероксидазы и активности одной о–дифенолоксидазы:

Е_n = Е_o+n – Е_o

Результаты записывают в таблицу 6.

Таблица 6 - Основные параметры опыта и его результаты

Где: Vo– объем, пошедший на титрование опытной пробы, мл 0,01 н I₂;

Vk – объем, пошедший на титрование контрольной пробы, мл 0,01 н I₂;

Vk-Vo – разность показаний титрования контрольной и опытной пробы, мл 0,01 н I₂;

Еo+n – активность о–дифенолоксидазы и пероксидазы мл 0,01 н. I₂/г;

Еo – активность о–дифенолоксидазы, мл 0,01 н. I₂/г;

Еn – активность пероксидазы, мл 0,01 н. I₂ / г;

n– навеска, г.

Материалы и реактивы: картофель, солод, мука, капуста, хрен, яблоки; 0,3 М раствор ацетатного буфера рН = 4,7 (см. Приложение В, п.12); 0,1 %–ный раствор аскорбиновой кислоты; 0,02 М раствор пирокатехина; 0,4 %–ный раствор пероксида водорода; 10 %–ный раствор ортофосфорной кислоты; 0,01 н. раствор йода; крахмал, индикаторный раствор (см. Приложение В, п.13).

Оборудование: ступки; пипетки на 20 мл; колбы на 50 мл; микробюретки; центрифуга.

Дата добавления: 2015-08-06 | Просмотры: 520 | Нарушение авторских прав