И пероксидазы по Михлину и Броневицкой
Принцип метода определения активности о –дифенолоксидазы и пероксидазы основан на вторичном окислении аскорбиновой кислоты хинонами, образующимися из пирокатехина под действием ферментов. Избыток неокисленной кислоты оттитровывают йодом:
Н
½
| | | | Н
½
| | С
// \
| | | | С
// \
| | Н¾ С С ¾ ОН
½ || + 1/2 О 2
| полифенолоксидаза ¾¾¾¾¾¾¾¾>
| Н¾ С С = О
½ | + Н2О
| | Н¾ С С ¾ ОН
\\/
С
| | Н¾ С С = О
\\/
С
| | ½
Н
| | | | ½
Н
| | пирокатехин
| | | | о-хинон
| | О= С ¾¾
| Н
| | Н
| | О= С ¾¾
| ½
| ½
| | ½
| | ½
| НО¾С
| С
| | С
| | О = С
| || О
| //\
|
| //\
| | ½ О
| НО¾С +
| Н¾ С С = О
| | Н¾ С С¾ ОН
| | О = С
| ½
| ½ ½
| ¾¾>
| ½ ||
| +
| ½
| Н¾С¾¾
| Н¾ С С = О
| | Н¾ С С ¾ ОН
| | Н ¾ С ¾¾
| ½
| \\ /
| | \\ /
| | ½
| НО¾С¾Н
| С
| | С
| | НО¾С¾Н
| ½
| ½
| | ½
| | ½
| СН2ОН
| Н
| | Н
| | СН2ОН
| аскорбиновая о - хинон пирокатехин дегидроаскорбиновая
кислота кислота
|
| | | |
| |
| | | |
| | О=С ¾¾
| | | | О= С ¾¾
| | ½
| | | | ½
| | НО¾С
| | | | НО¾С¾ J
| | || О
| | | | ½ О
| | НО¾С +
| J2
| ¾¾>
|
| НО¾С¾ J
| | ½
| | | | ½
| | Н¾С¾¾
| | | | Н¾С¾¾
| | ½
| | | | ½
| | НО¾С¾Н
| | | | НО¾С¾Н
| | ½
| | | | ½
| | СН2ОН
| | | | СН2ОН
| | неокисленная a,b дииод-
аскорбиновая кислота аскорбиновая кислота
| | | | | | | | | | | | | | | | | Ход работы. Получение ферментной вытяжки.
3 г. испытуемого материала растирают в ступке с 20 мл 0,3 М ацетатного буфера с рН 4,7, переносят в колбу и оставляют на 30 минут для настаивания при комнатной температуре. После настаивания вытяжку центрифугируют.
Определение активности о–дифенолоксидазы (Е0). К 1 мл центрифугата (ферментная вытяжка) добавляют 3 мл дистиллированной воды, 2 мл 0,1 %–ного раствора аскорбиновой кислоты и 1 мл 0,02 М раствора пирокатехина. Смесь встряхивают 2 минуты, добавляют 1 мл 10 %–ного раствора фосфорной кислоты и титруют из микробюретки 0,01 н раствором йода в присутствии нескольких капель крахмала. Параллельно проводят контрольное определение с прокипяченной вытяжкой (1 мл вытяжки и 3 мл дистиллированной воды кипятят 1 минуту, затем добавляют 1 мл воды взамен испарившейся при кипячении, и все необходимые реактивы, как и в случае с опытной пробой).
Активность выражают в мл 0,01 н раствора йода на 1 г испытуемого материала по разности контрольной и опытной пробы.
Определение суммарной активности о –дифенолоксидазы и пероксидазы в присутствии перекиси водорода (Ео+n).
К 1 мл центрифугата добавляют 3 мл дистиллированной воды,1 мл 0,4%–ного раствора перекиси водорода, 2 мл 0,1%–ного раствора аскорбиновой кислоты и 1 мл 0,02 М раствора пирокатехина. (Все растворы и вода должны иметь температуру 18–20 °С). Смесь встряхивают 2 минуты, добавляют 1 мл 10%–ного раствора фосфорной кислоты и титруют из микробюретки 0,01 н раствором йода в присутствии крахмала.
Активность пероксидазы (Еn) определяют по разности суммарной активности о–дифенолоксидазы и пероксидазы и активности одной о–дифенолоксидазы:
Еn = Еo+n – Еo
Результаты записывают в таблицу 6.
Таблица 6 - Основные параметры опыта и его результаты
Материал
| Ферменты
|
| о- дифенолоксидаза и пероксидаза
| о-дифенолоксидаза
| пероксидаза
|
| Vo
| Vk
| Vk-Vo
| Ео+п
(Vk-Vo)20
¾¾¾
n
| Vo
| Vk
| Vk-Vo
| Ео
(Vk-Vo)20
¾¾¾
n
|
Еn = Еo+n – Еo
|
|
|
|
| | | | | | | | | | |
Где: Vo– объем, пошедший на титрование опытной пробы, мл 0,01 н I2;
Vk – объем, пошедший на титрование контрольной пробы, мл 0,01 н I2;
Vk-Vo – разность показаний титрования контрольной и опытной пробы, мл 0,01 н I2;
Еo+n – активность о–дифенолоксидазы и пероксидазы мл 0,01 н. I2/г;
Еo – активность о–дифенолоксидазы, мл 0,01 н. I2/г;
Еn – активность пероксидазы, мл 0,01 н. I2 / г;
n– навеска, г.
Материалы и реактивы: картофель, солод, мука, капуста, хрен, яблоки; 0,3 М раствор ацетатного буфера рН = 4,7 (см. Приложение В, п.12); 0,1 %–ный раствор аскорбиновой кислоты; 0,02 М раствор пирокатехина; 0,4 %–ный раствор пероксида водорода; 10 %–ный раствор ортофосфорной кислоты; 0,01 н. раствор йода; крахмал, индикаторный раствор (см. Приложение В, п.13).
Оборудование: ступки; пипетки на 20 мл; колбы на 50 мл; микробюретки; центрифуга.
Дата добавления: 2015-08-06 | Просмотры: 514 | Нарушение авторских прав
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 |
|