АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология
|
Определение специфичности лактатдегидрогеназы
Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует превращение пирувата в лактат на последней стадии гликолиза:
| О
|
|
|
| О
|
|
|
|
| //
|
|
|
| //
|
|
|
|
| С¾ОН
|
| +
| ЛДГ
| С¾ОН
|
| +
|
|
| ½
| + НАДН
| + Н
| ¾¾¾¾>
| ½ +
|
| НАД
|
|
| С = О
|
|
|
| Н¾С¾ОН
|
|
|
|
| ½
|
|
|
| ½
|
|
|
|
| СН3
|
|
|
| СН3
|
|
|
| пируват лактат
Принцип метода. В ходе реакции кофермент НАДН + Н+ окисляется до НАД+ и поглощение при 340 нм, характерное для НАДН + Н+, уменьшается. Учитывая коэффициент молярной экстинкции НАДН, равный при 340 нм 6,22×10–3, рассчитывают скорости ферментативной реакции в микромолях/мин. Для проверки специфичности ЛДГ можно вместо пирувата использовать другую кетокислоту –оксалоацетат или a–кетоглутарат.
Ход работы. В кювету спектрофотометра помещают 1 мл раствора пирувата; 1,7 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,5); 0,2 мл раствора НАДН + Н+ и 0,1 мл раствора ЛДГ (или 0,1 мл сыворотки) и измеряют поглощение при 340 нм с интервалом 1 мин в течение 10 минут.
Отдельно измеряют поглощение в пробе, содержащей вместо ЛДГ 0,1 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,5 (контрольная проба). Количество образовавшегося НАД+ рассчитывают по разнице между величиной поглощения в контрольной пробе при 340 нм и величиной поглощения в каждый момент времени протекания реакции.
Рассчитывают скорость реакции в микромолях/мин и строят график зависимости скорости реакций от времени, находят начальную скорость ферментной реакции.
Аналогично проводят определение с раствором оксалоацетата и делают вывод о специфичности действия ЛДГ.
Материалы и реактивы: фосфатный буфер, рН 7,5 (см. Приложение В, п.2); раствор ЛДГ в 0,1 М фосфатном буфере, (рН 7,5), 5 мкг в 1мл, или сыворотка как источник ЛДГ; раствор НАДН в 0,1 М фосфатном буфере, 2 мг/мл; раствор пирувата или оксалоацетата 10–3 М в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,5.
Дата добавления: 2015-08-06 | Просмотры: 495 | Нарушение авторских прав
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 |
|