АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Глюкозоксидазы

Принцип метода. Глюкозоокидаза катализирует окисление глюкозы кислородом воздуха с образованием глюконовой кислоты и пероксида водорода:

Глюкозоокидаза

С₆Н₁₂О₆ + Н₂О + О₂ ¾¾¾¾¾¾¾® С₆Н₁₂О₇ + Н₂О₂

Перекись водорода под действием другого фермента – пероксидазы – окисляет какой–либо хромогенный субстрат с образованием окрашенного соединения. Обычно используют о–дианизидин:

 

 

Продукт окисления в сильно кислой среде имеет интенсивную окраску. Метод позволяет избирательно определить содержание глюкозы в присут-ствии любых других сахаров.

Ход работы. Раствор 3 доводят до температуры 18–25 °С. В обычные пробирки помещают по 2 мл этого раствора, добавляя по 0,1 мл раствора глюкозы и оставляют при температуре 18–25 °С в темноте (во избежании фотоокисления) на 1,5 ч. Параллельно ставят 2 контрольных опыта (по 0,1 мл воды) и один стандарт (0,1 мл стандартного раствора глюкозы). По окончании реакции во все пробирки добавляют по 2 мл 16 н. раствора Н₂SО₄ и тщательно перемешивают растворы. Интенсивность окраски стандартного раствора и обычных проб измеряют на ФЭКе против контроля при 530 нм. Содержание глюкозы определяют, сравнивая поглощение опытного D_оп и стандартного D_ст растворов:

, (1)

где С_х – содержание глюкозы, мкг/мл;

D_оп – экстинкция (оптическая плотность) опытной пробы;

Dст– экстинкция (оптическая плотность) стандартного раствора.

Диапазон чувствительности метода: 20 – 150 мкг/мл глюкозы.

Мат е риалы и реактивы: раствор 1 - раствор ферментов (см. Приложение В, п.5); раствор 2 - о–дианизидина в воде, концентрация 4,75 мг/мл. Растворы 1 и 2 хранят в холодильнике до 6 месяцев, перед определением готовят раствор 3 (см. Приложение В, п.6); 16 н. раствор Н₂SО₄; стандартный раствор глюкозы 150 мг/мл.

Оборудование: пробирки; пипетки; черная бумага; аптечные резинки; фотоэлектроколориметр.

Дата добавления: 2015-08-06 | Просмотры: 500 | Нарушение авторских прав