АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Генная инженерия и биобезопасность

Производство продуктов микробного синтеза — безусловно одно из самых развитых направлений современной промышленности. Однако многие достижения современной биотехнологии связаны не только с использованием метаболитов микробов. Многие проблемы медицины, пищевой промышленности, сельского хозяйства решаются с применением организмов с модифицированном геномом. С 1982 г. ряд фирм Европы, США и Японии производят инсулин человека, выделяемый из культуральной жидкости кишечной палочки. Из 1000 л бактериальной культуры получают около 200 г человеческого инсулина. Такое количеству ранее получали из 1600 кг тканей поджелудочной железы животных. Новый продукт позволяет избежать развития аллергических реакций на животный инсулин. Необходимый для сыроваренной промышленности телячий тимозин продуцируется дрожжами. Лимфокины, иммуноглобулины (Ig) и многие другие медицинские препараты получают с помощью трансгенных микроорганизмов, в которые введены соответствующие гены человека. Наметилась тенденция применения в качестве организмов-реципиентов генов не только бактерий, но и высших животных. Например, в 1994 г. гены белков женского молока были введены трансгенному быку, его потомство даёт молоко улучшенного качества, используемое для детского питания. По оценкам экспертов, в 2000 г. стоимость продукции, выпускаемой в США на основе генно-инженерных методов, достигнет 50 млрд долларов.

Теоретическая база генной инженерии. Интенсивное развитие молекулярной биологии началось после открытия (Дж. Уотсон, Ф. Крик, М. Уилкинс, 1953) структуры наследственного материала живой клетки (ДНК) и последующей расшифровки принципов генетического кодирования. Последовательность пар оснований кодирует порядок расположения аминокислот в пептидной молекуле. Основу молекулярной биологии составляет принцип комплементарности: ДНК — саморепродуцирующаяся молекула; кроме самой себя, она способна воспроизводить копии химически родственного полимера — рибонуклеиновые кислоты, которые, в свою очередь, служат матрицами для производства клеточных белков. Белок или комплекс белков определяют конкретный признак живого организма. Этот путь — центральная догма молекулярной биологии: ДНК «ДНК «РНК ® белок ® признак. Первая двунаправленная стрелка символизирует процесс репликации (удвоения ДНК), вторая — процесс транскрипции, который, в случае РНК-содержащих вирусов, может также идти в обратном направлении от РНК к ДНК.

Организация генетического материала. Гены [от греч. genos, рождение] — единица наследственности, участок ДНК, занимающий специфическое место в хромосоме. С точки зрения генетики, ген — наследуемый фактор и неделимая единица генетического материала. Структурный ген (цистрон) — фрагмент ДНК, участвующий в образовании полипептидной цепи. В его состав входят лидерная последовательность, кодирующие фрагменты (экзоны), вставочные последовательности (интроны) и концевая последовательность. Поскольку некоторые белки состоят более чем из одной субъединицы, формулировку «один ген — один фермент» применительно к гетеромультимерному (то есть состоящему из двух и более различных полипептидных субъединиц) белку следует трактовать как «один ген — одна полипептидная цепь».

Генотип — совокупность генов организма. Ещё в древности люди эмпирически использовали закономерности наследования. На основании этого опыта получила развитие селекция [от лат. selectio, выбирать] — наука о методах создания новых сортов растений и пород животных путём отбора и скрещивания. До недавнего времени генотип казался неприступным, не подвластным действиям человека. Открытие структуры генов позволило выделять их в изолированном виде, синтезировать биохимически и даже вводить в организм. Стало возможным воздействие на ген без его выделения из организма. Всё это создало предпосылки для манипулирования генотипом.

В 80-е годы ХХ в. появилось новое понятие — генная инженерия — раздел молекулярной генетики, связанный с конструированием не существующих в природе сочетаний генов при помощи генетических и биохимических методов. Впервые введение чужеродного гена и изменение признаков организма осуществили английские микробиологи О. Эвери, К. МаклЌод и М. МакКЊрти (1944). Из клеток пневмококка (серовар III) они выделили трансформирующий фактор (как выяснилось впоследствии, последовательность ДНК). После обработки этим фактором часть непатогенных бактерий серовара IIR превратилась в патогенные, причем именно серовара III. Это была первая демонстрация факта, что некие факторы могут передаваться от клетки к клетке, изменяя ёе наследственные свойства. В 1972 г. Пол Берг с сотрудниками сообщили о получении in vitro рекомбинантной ДНК, состоящей из фрагментов разных молекул ДНК — вирусной (в том числе фаговой) и бактериальной. Иными словами, речь шла о получении энзимологическими методами (при помощи ферментов рестриктаз) синтетической генной конструкции. Позднее были предложены новые методы выявления ДНК: блот-гибридизация, увековечившая имя его создателя Э. СЊузерна в английском названии метода southern blotting (1975); методы секвенирования ДНК (анализ первичной последовательности нуклеотидов в цепочке ДНК), основанные П. Сэнджером. В настоящее время для получения доступного для анализа и дальнейших манипуляций количества фрагмента ДНК применяют метод ПЦР, разработанный Нобелевским лауреатом (1994) американцем Кеем Мюллисом. Процедура получения и использования синтетической генной конструкции, состоит из нескольких этапов.

• Внедрение интересующего исследователей гена (выделенного, модифицированного либо синтезированного) в векторную молекулу ДНК in vitro с помощью рекомбинации. В роли вектора может выступать плазмидная ДНК, либо нуклеиновая кислота вируса или фага. Например, ген ИФН человека вводят в геном бактериофага l.

• Введение рекомбинантной (гибридной) векторной ДНК в клетку. В рассматриваемом примере этот этап заключается в заражении клеток кишечной палочки гибридными фагами.

• Отбор клеток, экспрессирующих введённый ген (молекулярное клонирование).

• Культивирование отобранных клонов.

Введение чужеродного гена в организм приводит к изменению свойств и признаков последнего, то есть к созданию генно-инженерно модифицированного организма. Модифицированный генно-инженерно организм — клетка, группа клеток или вирус, содержащие генетический материал, полученный с применением методов генной инженерии. Известны три способа воздействия на генотип организма.

Трансформация бактериальных клеток в результате включения экзогенной ДНК приводит к появлению нового генетического маркёра. Для эукариот аналогичный процесс — трансфекция эукариотических клеток (в связи с тем, что термин «трансформация» обозначает переход в состояние неконтролируемого роста и применяется по отношению к опухолевому перерождению клеток).

Избирательная инактивация гена («адресное» разрушение гена, «антисмысловая» блокировка гена или производимой им РНК), позволяющая вывести из строя любой ген внутри клетки. Этот процесс известен также как «нокаутирование» [от англ. to knock out, сбивать с ног], а модифицированные организмы — как нокаутные.

Направленное изменение гена (адресный мутагенез in vivo, генная инженерия in vitro — ex vivo) по желанию исследователя.

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 1026 | Нарушение авторских прав