Временной ход ферментативной реакции
Допущения стационарности:
- Анри, Михаэлис и Ментен – быстрое равновесие к-1 >> к+2
- Ван-Слайк и Куллен – необратимость первой стадии k+2 >> к-1
- Бриггс и Холдейн – отказ от неравенств Км, концентрация ES не меняется
Вывод уравнения М-М: Для фермент-субстратного комплекса применим метод квазистационарности, так как в подавляющем большинстве реакций константа скорости превращения фермент-субстратного комплекса в фермент и продукт много больше, чем константа скорости образования ферменто-субстратного комплекса из фермента и субстрата. Иными словами:
Учтем тот факт, что фермент, изначально находившийся только в свободной форме, в процессе реакции находится как в виде фермент-субстратного комплекса, так и в виде молекул свободного фермента. Таким образом:
И подставим в первое уравнение. После раскрытия скобок и группировки слагаемых получим следующее:
Выразим отсюда концентрацию фермент-субстратного комплекса:
Скорость ферментативной реакции в целом (то есть скорость образования продукта) представляет собой скорость распада фермент-субстратного комплекса по реакции первого порядка с константой k2:
Подставим в эту формулу выражение, которое мы получили для концентрации ES. Получим:
Разделим числитель и знаменатель на k1. В результате:
Выражение в знаменателе — (k-1+k2)/k1 — называется константой Михаэлиса (Km). Это кинетическая константа (с размерностью концентрации), которая равняется такой концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции составляет половину от максимального значения.
Для начальной стадии реакции можно пренебречь уменьшением концентрации субстрата. Тогда выражение для начальной скорости реакции будет выглядеть так:
Если k-1>k2, то на первой стадии ферментативной реакции с течением времени устанавливается равновесие (квазиравновесный режим протекания реакции), и в выражение для скорости ферментативной реакции входит уже не константа Михаэлиса, а субстратная константа KS, характеризующая взаимодействие фермента с субстратом в равновесных условиях:
;
По значению KS можно судить о химическом сродстве субстрата к ферменту.
Физический смысл Км в случае допущений: при допущении 1 к-1/к+1 – характеризует сродство к субстрату, при допущении 2 к2/к1 – характеризует каталитические свойства фермента.
Кривая Михаэлиса (зависимость скорости реакции от конц. субстрата)
Ферментативный процесс можно выразить следующим уравнением:
Скорость реакции пропорциональна концентрации фермент-субстратного комплекса ES, a скорость образования ES зависит от концентрации субстрата и концентрации свободного фермента. На концентрацию ES влияет скорость формирования и распада ES. Наибольшая скорость реакции наблюдается в том случае, когда все молекулы фермента находятся в комплексе с субстратом, т.е. в фермент-субстратном комплексе ES, т.е. [Е] = [ES].
Модель Михаэлиса-Ментен основывается на нескольких не совсем реальных допущениях, таких, как необратимое превращение EA в E + В, достижение равновесия между E, A и EA, отсутствие в растворе других форм фермента, кроме E и EA.
применимость ур-ия ММ: реакция односубстратная, реакция необратима, быстрое наступление равновесия на стадии образования ФСК, стационарный режим протекания, эффектами продукта можно пренебречь, S ≫ E, S ~ S0. если k -1 ≫ k 2, то K M ~ K S (чем меньше K M, тем выше сродство фермента к субстрату), k 2 – число оборотов
Линеаризация, линеаризующие преобразования (линейные анаморфозы):
- Лайнуивера-Берка
- Иди-Хофсти
- Хейнза-Вульфа
считается наиболее адекватным, поскольку практически не изменяет величину и форму модели экспериментальной ошибки.
непараметрическое определение констант:
Строится параметрический график. Оси координат – кинетические параметры Vm, Km. Мы знаем как скорость зависит от субстрата. Берем их значения, пересечения с осями показывают кинетические параметры. Плюс – нет той погрешности, которая заложена в линеаризации. В идеале все прямые должны пересекаться в одной точке.
Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 898 | Нарушение авторских прав
|