АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология
|
Процедура трансформации
- Возьмите две закрытые микроцентрифужные пробирки. Напишите на одной микроцентрифужной пробирке +pGLO, на другой –pGLO, а также ваш класс и фамилию. Поставьте пробирки в штатив.
- Откройте пробирки и чистой одноразовой пипеткой добавьте по 250 мкл раствора для трансформации (CaCl2) в каждую пробирку.
- Поставьте пробирки на лед
- С помощью стерильной петли, возьмите 2-4 крупных колонии с вашей «стартовой» чашки. Важно выбирать именно отдельные колонии, так как для успеха трансформации клетки должны активно расти. Возьмите пробирку «+pGLO» и погрузите петлю в трансформационный раствор на дне пробирки. Покрутите петлю между большим и указательным пальцами, чтобы вся колония равномерно размешалась в буфере (без плавающих комков). Поставьте пробирку обратно на лед. Возьмите новую петлю и повторите процедуру для пробирки «-pGLO»
- Рассмотрите раствор плазмиды pGLO под ультрафиолетом. Запишите ваши наблюдения. Окуните новую стерильную петлю в раствор плазмиды. Выньте петлю. На кольце должна быть натянута пленка плазмиды (как пленка мыльного раствора на кольце, когда вы выдуваете пузыри). Помешайте петлей суспензию клеток в пробирке «+pGLO». (если у вас есть микропипетка, добавьте 10 мкл раствора плазмиды микропипеткой и перемешайте). Закройте пробирку и верните ее обратно на лед. Не добавляйте ДНК в пробирку «-pGLO».- это контроль.
Держите пробирки на льду в течение 10 минут. Убедитесь в том, что вы засунули пробирки достаточно глубоко в штатив, так что их нижняя часть погружена в лед.
- Пока пробирки стоят на льду, подпишите ваши четыре чашки на нижней стороне (не на крышке) как показано на картинке, т.е.:
обозначьте одну чашку LB/amp «+pGLO», другую – «-pGLO». Обозначьте чашку LB без антибиотика – «-pGLO» и чашку LB/amp/ara – «+pGLO»
- Тепловой шок. Возьмите штатив с пробирками и быстро перенесите его изо льда на нагретую до 42ºС водяную баню РОВНО на 50 секунд. Убедитесь, что пробирки погружены в воду. Как только 50 секунд пройдут, поставьте штатив обратно на лед. Для хороших результатов важно быстро переместить пробирки изо льда (0ºС) на водяную баню (42ºС) и потом обратно на лед (0ºС). Подержите пробирки на льду две минуты.
- Снимите штатив со льда и поставьте на стол. Откройте первую пробирку, возьмите чистую стерильную пипетку и добавьте 250 мкл питательной среды LB в пробирку. Снова закройте ее. Повторите процедуру для второй пробирки, обязательно взяв новую стерильную пипетку. Перемешайте суспензию и оставьте на 10 мин на столе.
- Легко встряхните пробирки пальцем, чтобы перемешать. Нанесите по 100 мкл суспензии из каждой на чашки, в соответствии с рисунком. Используйте новую стерильную пипетку для каждой пробирки. Сразу же закрывайте чашки, чтобы минимизировать загрязнение. Не держите чашки открытыми!
- Откройте первую чашку и быстро размажьте суспензию по поверхности чашки с помощью стерильной петли. Не нажимайте сильно на петлю, водите ее легко по поверхности, чтобы не поцарапать агар. Сразу же закройте чашку, чтобы минимизировать загрязнение и переходите к следующей чашке. Используйте новую стерильную петлю для каждой чашки.
- Сложите ваши чашки в стопку и склейте вместе скотчем. Напишите на дне нижней чашки ваши фамилии и класс, переверните стопку, чтобы образующийся на крышке конденсат не капал на поверхность агара, и поставьте в термостат/оставьте на столе.
Вопросы к уроку 2
- На какой из засеянных чашек вы ожидаете увидеть бактерий, наиболее похожих на исходные колонии, которые вы брали для трансформации? Объясните ваш ответ
- На какой чашке (чашках) вы ожидаете найти трансформированные клетки, если такие будут?
- Какие чашки нужно сравнивать между собой, для того, чтобы определить насколько удалась трансформация? Почему?
- Что означает понятие «контрольная чашка»? Для чего нужен контроль?
Дата добавления: 2015-10-11 | Просмотры: 585 | Нарушение авторских прав
|