Теоретические сведения. Первые сведения об общей организации и тонкой структуре клетки были получены с помощью оптических методов

Осветительная часть микроскопа состоит из двухлинзового конденсора, ирис-диафрагмы и патрона с низковольтной лампочкой накаливания, питающейся через понижающий трансформатор от сети напряжения 120…220 В. Конденсор служит для лучшего освещения препарата. Он собирает световые лучи в пучок и направляет их через отверстие предметного столика на препарат. С помощью рукоятки для перемещения кронштейна конденсора его можно перемещать вверх и вниз, благодаря чему меняется угол сходимости лучей и, следовательно, степень освещения объекта. Чем выше положение конденсора, тем лучше освещен препарат. Ирис-диафрагма располагается под конденсором и служит для регулировки потока света, поступающего в конденсор. Она состоит из металлических серповидных пластинок. Расширить или сузить отверстие диафрагмы можно с помощью специального рычажка. При вращении его по часовой стрелке отверстие ирис-диафрагмы увеличивается и, следовательно, увеличивается степень освещения объекта. При работе с иммерсионными объективами степень освещения препарата должна быть максимальной, поэтому шторку ирис-диафрагмы открывают, а конденсор поднимают в крайнее верхнее положение. При работе с сухими объективами, как правило, рассматривают неокрашенные объекты. Для достижения контрастности конденсор опускают вниз, а отверстие ирис-диафрагмы уменьшают.

Микроскопия в темном поле. Микроскопия в темном поле основана на освещении объекта косыми лучами света. Эти лучи не попадают в объектив, поэтому поле зрения выглядит темным. Если препарат содержит клетки микроорганизмов, то косые лучи, проходя через такой препарат, в значительной степени отражаются от поверхности клеток и на­столько уклоняются от своего первоначального направления, что попадают в объектив. Тогда наблюдатель видит на черном фоне интенсивно светящиеся объекты, даже если их диаметр в 10 раз меньше, чем предел разрешения объектива. Такое освещение пре­парата достигается применением специального конденсора. Темнопольный конденсор имеет затемненную среднюю часть, поэтому центральные лучи света, идущие от осветителя, задер­живаются, а в плоскость препарата попадают только боковые лу­чи, отраженные от зеркальных поверхностей, расположенных внутри конденсора. При микроскопировании в темном поле можно увидеть объек­ты, величина которых измеряется сотыми долями микрометра, т.е. лежит за пределами видимости обычного микроскопа. Однако на­блюдение объектов в темном поле позволяет различить только их контуры, но не дает возможности рассмотреть внутреннее строе­ние.

Микроскопия с фазово-контрастным устройством. Микроскопия с фазово-контрастным устройством основана на том, что с его помощью различия в фазе световых лучей, возни­кающие при прохождении их через прозрачные объекты, превра­щаются в амплитудные, в результате чего объекты становятся контрастными. Глаз человека выявляет различия в длине волны света (цвет) и ее амплитуде (интенсивность, яркость), но не в со­стоянии заметить смещение фазы. Неокрашенные клетки микро­организмов хорошо видны в проходящем свете обычного светлопольного микроскопа только в том случае, когда значительная часть энергии света, прошедшего через них, поглощается. При этом выходящая из объекта (клетки) световая волна имеет мень­шую амплитуду, т. е. яркость, и этот объект воспринимается гла­зом наблюдателя как более темный, контрастный по сравнению с окружающей средой. Однако многие микроорганизмы, размеры которых лежат в пределах разрешающей способности микроско­па, мало отличаются по прозрачности (плотности) от окружаю­щей среды. Амплитуда световой волны, проходящей через клетки таких микроорганизмов, почти не меняется, поэтому объекты пло­хо различимы или даже невидимы в обычный светлопольный микроскоп. Поле зрения кажется наблюдателю почти однород­ным.

Объект можно сделать более контрастным, либо почти до пре­дела закрывая диафрагму конденсора, либо окрашивая клетки, либо применяя фазово-контрастное устройство. Первое нежела­тельно, так как снижает апертуру конденсора и тем самым замет­но уменьшает разрешающую способность микроскопа. Окраши­вание препарата дает хорошие результаты, но в большинстве слу­чаев оно осуществляется после фиксации микроорганизмов, что не всегда желательно. Основная ценность метода фазового контраста состоит в том, что он дает возможность наблюдать живые объек­ты, не прибегая к их фиксации и окрашиванию. Применение фазово-контрастного устройства не позволяет увеличить разрешаю­щую способность микроскопа, но дает возможность увидеть прозрачные объекты более четко и даже выявить некоторые структуры и включения в клетках крупных бактерий.

Оптическая система, используемая для получения фазового контраста, состоит из фазовой пластинки и кольцевой диафрагмы. Фазовая пластинка расположена в задней фокальной плоскости объектива и представляет собой прозрачный диск, на котором напылено кольцо из металлов. Кольцевая диафрагма расположена под конденсором и представляет собой прозрачную щель в виде кольца на непроницаемой для света пластинке. Световая волна, проходя через клетки микроорганизмов, отстает по фазе пример­но на 1/4, относительно прямых волн, прошедших только через окружающую среду. В объективе микроскопа эти две волны ин­терферируют. Результирующая волна имеет ту же длину и ам­плитуду, что и прямая, но несколько отличается от нее по фазе. Этого отличия оказывается недостаточным, чтобы частицу можно было заметить в обычный микроскоп. Для превращения разности фаз в разность амплитуд служит фазовая пластина, которая до­полнительно сдвигает дифрагированный луч на 1/4.

Фазовый эффект создается в результате интерференции пря­мых лучей, не отклонившихся при прохождении через препарат, и боковых, дифрагированных лучей, которые благодаря прохожде­нию через объект и через фазовую пластинку либо совпадают по фазе с прямыми, либо сдвинуты относительно них на 1/2, т. е. находятся в противофазе. В первом случае обе волны складыва­ются и изображение объекта становится более светлым, чем ок­ружающий фон. Это светлый, негативный, контраст. По принципу негативного контраста устроен так называемый аноптральный микроскоп. Во втором случае дифракционная волна вычитается из прямой и объект выглядит более темным — темный, позитивный, контраст. Кроме того, кольцевая диафрагма уменьшает интенсивность центрального светового пучка, что также усилива­ет контрастность. Все фазовые объективы имеют на оправе обоз­начение «ф». Ими можно пользоваться и при обычной микроско­пии, но из-за наличия фазового кольца они дают изображение пониженной четкости.

Люминесцентная микроскопия. Люминесцентная микроскопия основана на способности мно­гих веществ биологического происхождения и красителей све­титься под воздействием падающего на них света. Молекулы веществ, способных к люминесценции, поглощают энергию падающего света и переходят в возбужденное состояние, которое ха­рактеризуется более высоким энергетическим уровнем. В таком состоянии они находятся непродолжительное время и вновь возвращаются к исходному энергетическому уровню. Этот переход сопровождается отдачей избытка энергии в виде света — люми­несценцией. Как правило, для возбуждения люминесценции объ­ект освещают ультрафиолетовыми лучами с длиной волны 300 — 400 нм или сине-фиолетовыми лучами с длиной волны 400 — 460 нм.

Ряд веществ биологического происхождения — хлорофилл, ви­тамин В₂, алкалоиды, каротиноиды, порфирины, некоторые анти­биотики и другие соединения обладает собственной люминесцен­цией. В зависимости от содержания таких веществ в клетке ряду микроорганизмов, например, зеленым водорослям, некоторым дрожжам и бактериям, свойственна первичная люминесценция. Однако клетки большинства микроорганизмов люминесцируют очень слабо, поэтому их обрабатывают специальными красителя­ми — флуорохромами, обладающими люминесценцией. Люминес­ценцию объекта после обработки флуорохромами называют наве­денной, или вторичной.

Люминесцентная микроскопия увеличивает контрастность изо­бражения, дает возможность различить отдельные клеточные структуры и даже отметить их изменения при различных функ­циональных состояниях клетки. Этот вид микроскопии широко применяют для цитологических исследований, выявления живых и мертвых клеток, для изучения микроорганизмов в почвах, илах и ризосфере растений.

Люминесценцию в сине-фиолетовых лучах видимого света можно наблюдать с помощью обычного микроскопа, установив на пути лучей синий стеклянный или жидкий светофильтр, пропус­кающий сине-фиолетовые лучи видимого спектра. Синие лучи, мешающие выявлению люминесценции, убирают желтым свето­фильтром, который помещают на окуляр микроскопа. В результа­те наблюдатель видит на темном фоне люминесцирующие объек­ты. Однако для микробиологических исследований наиболее удо­бен люминесцентный микроскоп, в котором люминесценция воз­буждается сине-фиолетовыми лучами и ближним ультрафиолетом. Чаще свет, возбуждающий люминесценцию, направляется на пре­парат сверху, через объектив. При освещении объектов сверху (для возбуждения люминесценции) одновременно допускается освещение объектов снизу с помощью конденсора темного поля или фазово-контрастного устройства. Люминесцентный микроскоп также позволяет исследовать объекты в видимой обла­сти спектра в проходящем и отраженном свете в темном поле. Устройство люминесцентного микроскопа и порядок работы даны в описании каждой конкретной модели и здесь не приводятся.

Электронная микроскопия. В отличие от световых микроскопов электронные обслужива­ются специалистами по их эксплуатации. Предел разрешения электронного микроскопа на три порядка выше, чем светового, и достигает 0,1 нм. В практике биологических исследований дости­гается разрешение 0,5—1,0 нм. Получаемое при этом увеличение составляет 5000—50000 крат (на экране микроскопа и фотоплен­ке) и может быть повышено еще в 5—10 раз при фотопечати (в этом случае, однако, новых элементов структуры не выявляется, просто становятся видны мелкие детали, размеры которых мень­ше разрешения человеческого глаза, но больше размеров зерен фотоэмульсии).

Электронный микроскоп в отличие от светового позволяет ис­следовать только неживые высушенные объекты, так как образец находится в условиях высокого вакуума и интенсивного электрон­ного облучения. Принцип возникновения изображения в электрон­ном микроскопе иной, чем в световом. Как уже отмечалось, в световом микроскопе контраст обусловлен избирательным погло­щением света различных длин волн элементами структуры объек­та (адсорбционный контраст) или изменением фазы световой вол­ны при прохождении света через объект (фазовый контраст), тог­да как в электронном микроскопе контраст вызван отклонением ускоренных электронов тяжелыми атомами, входящими в состав тонкопленочного объекта (или искусственно внесенными в него при «химическом» контрастировании). Такой контраст называют дифракционным. Абсорбционный контраст в электронном микро­скопе — явление нежелательное (поглощение энергии электро­нов приводит к хроматической аберрации, а часто и к тепловому разрушению образца), и с ним приходится бороться, исследуя объект в виде ультратонких (30—100 нм) срезов и пленок.

Основной частью электронного микроскопа является вакуум­ная колонна, в которой последовательно расположены по прин­ципу осевой симметрии электронная пушка, содержащая катод и анод, а также ряд магнитных линз и люминесцирующий экран. Электронная пушка обеспечивает эмиссию и ускорение электро­нов. Часть электронов проходит через отверстие в центре анода (центральную апертуру) и образует электронный луч, который фокусируется первой магнитной линзой (конденсорной) и освеща­ет объект. Прошедшие через объект электроны фокусируются второй магнитной линзой (объективной), формирующей увеличен­ное изображение объекта, которое затем дополнительно увеличи­вается третьей магнитной линзой (проекционной) и проецируется на люминесцирующий экран или фотопленку.

Электронный микроскоп, создающий изображение благодаря прохождению (просвечиванию) электронов сквозь тонкопленоч­ный образец, называется просвечивающим или трансмиссионным (ТЭМ). Он позволяет выявить детали внутреннего строения мик­роорганизмов, а также особенности их взаимодействия в анали­зируемом образце. Предварительно образец фиксируют химичес­ки, заливают в различные смолы и контрастируют солями тяже­лых металлов. Часть электронов проходит через объект, часть в той или иной степени рассеивается тяжелыми атомами, связав­шимися с компонентами структуры, вследствие чего и формиру­ется контраст изображения. Необходимая для трансмиссионной микроскопии минимальная толщина образца обеспечивается при­менением специальных устройств для приготовления срезов — ультрамикротомов. Микроорганизмы и вирусы можно наблюдать в ТЭМ и без заливки в смолы. Для этого каплю суспензии поме­щают на пленку-подложку, высушивают и контрастируют хими­чески или физически — косым напылением металлов (оттенение).

В сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) или в про­свечивающем электронном микроскопе со сканирующей пристав­кой изображение на телевизионном экране получается вследствие того, что первичный электронный луч, сканируя поверхность об­разца, взаимодействует с электронными оболочками атомов веще­ства объекта, что вызывает различные вторичные излучения. Их относительная интенсивность зависит от характеристик облучае­мой поверхности рельефа, химического состава и электропровод­ности. Различия в интенсивности вторичных излучений преобра­зуются в изменение амплитуды электрических сигналов, что реги­стрируется на экране или фотопленке. Достигаемое при этом по­лезное увеличение меньше, чем в ТЭМ, и, как правило, не превы­шает 50 000 крат (разрешение порядка 3—5 нм). Сканирующая электронная микроскопия позволяет получить трехмерное (сте­реоскопическое) изображение и наиболее эффективна для выяв­ления поверхностных структур микроорганизмов, определения формы и архитектоники объекта. Предварительно образец фикси­руют химически, высушивают специальными методами и напыля­ют в вакууме золотом, платиной или палладием для повышения интенсивности вторичноэлектронной эмиссии и создания на по­верхности электропроводящего покрытия, снимающего поверхност­ный заряд.

Контрольные вопросы

1. Перечислите виды микроскопии;

2. Расскажите устройство светового микроскопа МБР-2;

3. Раскройте принцип работы фазово-контрастного устройства;

4. Укажите, в чем заключается суть работы люминесцентного микроскопа;

5. Расскажите особенности электронной микроскопии.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 632 | Нарушение авторских прав