АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Краткие теоретические сведения. Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций следующие.

Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций следующие.

1. Микроскопический метод исследования: а) в световом микроскопе; б) в люминесцентном микроскопе; в) в электронном микроскопе.

2.Выделение и культивирование вирусов путем заражения развивающихся куриных эмбрионов, лабораторных животных и культур клеток.

3.Серологический метод исследования (идентификация вирусов) — постановка серологических реакций (РЗГА, РН и др.).

4. Биологический метод.

5. Генетические методы (ПЦР, рестрикционный анализ).

Микроскопию в световом микроскопе проводят с целью выявления крупных вирусов-вирионов, внутриклеточных включений и изучения патологических изменений клеток, пораженных вирусами (ЦПД). Вирион — это зрелый внеклеточный вирус. Включения представляют собой вирусный материал, находящийся внутри клетки, в образовании которого участвуют и клеточные продукты. Вирионы могут быть обнаружены в мазках и препаратах-отпечатках из инфицированной ткани; включения — только в препаратах-отпечатках и гистосрезах, приготовленных из пора­женных органов и тканей.

Оспа овец, свиней и коров, эктима овец, оспа-дифтерит птиц — это такие инфекции, при которых обнаружение вирионов-возбудителей приобрело диагностическое значение. Для выявле­ния вирионов используют методы окрашивания, которые позво­ляют увеличить вирусную частицу в размерах и сделать ее более контрастной. В целях получения хороших результатов использу­ют чистые обезжиренные предметные стекла. Препараты готовят из тщательно размельченного материала или путем отпечатков стараясь сделать их как можно тоньше. При каждом вирусном заболевании учитывают, какие органы и ткани наиболее пораже­ны и какие участки их следует исследовать, выбирают также соответствующий метод фиксации. Существует ряд методов окра­ски вирионов.

Окраска по Морозову применяется в процессе диагностики оспы овец. Возбудителей болезни выявляют в препаратах-отпечатках, мазках из чистых суспензий. При иссле­довании последних на предметное стекло пастеровской пипеткой наносят небольшую каплю материала и распределяют ее тонким слоем, для окрашивания готовят три реактива.

Реактив №1 (фиксатор — жидкость Руге): 2 мл 40%-ного формальдегида (продажный формалин), 1 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мл дистиллированной воды.

Реактив №2 (протравитель): 5 г танина, 2 мл жидкого фено­ла, 100 мл дистиллированной воды (если появляется осадок, рас­твор фильтруют).

Реактив №3 (краситель): 5 г азотнокислого серебра раство­ряют в 100 мл дистиллированной воды, затем осторожно по кап­лям добавляют раствор 25%-ного аммиака до появления легкой опалесценции. Перед употреблением разводят дистиллированной водой 1:10.

Готовые препараты высушивают на воздухе, 2...3 мин отмывают дистиллированной водой в вертикальном положении. За­тем на них наносят реактив №1, через 1 мин его сливают, мазок промывают и наносят на 1...2 мин реактив №2, проводя препарат над пламенем спиртовки до появления паров. Далее мазок тща­тельно промывают дистиллированной водой и на 1...2 мин нано­сят реактив №3, прогревая препарат на огне, пока он не станет темно-коричневым. После этого препарат снова тщательно про­мывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют.

На светло-коричневом фоне препарата вирионы имеют вид темно-коричневых или черных точек, расположенных одиночно, попарно или в виде скоплений. Результат будет положи­тельным только в случае массового обнаружения характерных образований.

Окраска по Маккиавелло сводится к следующему. Высу­шенные нефиксированные пре­параты окрашивают 5 мин про­фильтрованным 0,25%-ным раствором основного фуксина, краситель сливают, а мазок бы­стро (1с) проводят через 0,5%-ный раствор лимонной ки­слоты, тщательно промывают водопроводной водой и окраши­вают 5-10 с 1%-ным раствором метиленовой сини. Затем препа­рат вновь промывают, высуши­вают и микроскопируют.

Вирионы окрашиваются в яркий рубиново-красный цвет, ци­топлазма клеток — в светло-синий, ядра — в темно-синий.

Окраска по Романовскому-Гимзе заключается в том, что препараты фиксируют в метиловом спирте 5 мин, нанося на них раствор краски Романовского-Гимзы (1 мл маточного раствора на 10... 15 м. дистиллированной воды), окрашивают 30... 60 мин, краску сливают и тщательно промывают дистиллированной водой в течение 10... 15 мин. Высушенные препараты лучше провести через абсолютный спирт, толуол и заключить в бальзам. Вирионы при этом способе окрашивания приобретают темно-фиолетовый цвет, фон препарата — голубой.

При некоторых вирусных инфекциях диагностическим при­знаком является образование в клетках особых включений. Они обнаруживаются при бешенстве, оспе, гриппе свиней, чуме собак, болезни Ауески и др. Специальными методами окраски выявля­ются как внутрицитоплазматические, тик и внутриядерные включения. Наиболее часто они используются при диагностике бешенства.

Окраска по Муромцеву. Препарат фиксируют метиловым спир­том, отмывают от фиксатора и окрашивают 10 мин синькой Мансона (в 100 мл кипящей дистиллированной веды растворяют 5-6 г химически чистой буры, добавляют 2 г метиленовой сини, охлаж­дают и фильтруют) в разведении 1:40. Непромытый мазок вы­держивают в 10%-ном растворе танина до тех пор, пока он не приобретет вместо сине-фиолетового цвета голубой. Затем его промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и в тече­ние нескольких секунд проводят через абсолютный спирт. После этого высушивают и микроскопируют. Включения Бабеша-Негри представляют собой фиолетовые образования различных размеров (0,2...20 мкм) и формы на голубом фоне цитоплазмы, ядра клеток ок­рашиваются в синий цвет.

Окраска по Манну. Препарат фиксируют в жидкости Буэна 2 ч и окрашивают 4 ч при 37 °С или 18 ч при комнатной температуре в растворе следующего состава:

17мл 1%-ного раствора метиленовой сини, 23 мл 1%-ного рас­твора эозина, 40 мл дистиллированной воды. Раствор готовят пе­ред употреблением. После окрашивания препарат тщательно про­мывают и обезвоживают в трех растворах щелочного спирта: 1) к 30 мл абсолютного спирта добавляют 30 капель 1%-ного раствора каустической соды в этом спирте, 2) к 30 мл абсолютного спирта добавляют 20 капель раствора соды, 3) к 30 мл абсолютного спир­та добавляют 10 капель раствора соды. Обезвоживание прекра­щают, если препарат принимает светло-розовый оттенок. Такой препарат проводят через абсо­лютный спирт и обезвоживают в кислом спирте (30 мл абсо­лютного спирта и 1 капля ле­дяной уксусной кислоты). На фоне голубых клеток видны ярко-красные включения, синие ядра и ядрышки клеток.

Окраска по Туревичу. Препарат фиксируют в метиловом спирте. Для проведения окраски необходимо иметь следующие реактивы: железный гематоксилин Вейгерта, 1%-ный водный раствор кислого фуксина, насыщенный раствор пикриновой ки­слоты, разведенный пополам 96° спиртом.

Для получения желез­ного гематоксилина Вейгерта готовят два состава: 1) 1%-ный рас­твор гематоксилина в 96° спирте. Раствор должен созревать в течение 2...3 недель;

2) 1,16 г хлористого железа, 98 мл дистил­лированной воды и 1 мл концентрированной соляной кислоты. Перед употреблением смешивают равные количества обоих раство­ров. Как только смесь приобретает фиолетовый оттенок, ее наносят на препарат и окрашивают 1...2 мин, промывают дистиллированной водой. Затем окрашивают 1%-ным водным раствором кислого фуксина в течение 1 мин и тщательно промывают дис­тиллированной водой до появления бледно-розового оттенка. После про­мывки дифференцируют раствором пикриновой кислоты в течение 10 - 20 с до появления желтого от­тенка. Препарат быстро прополаски­вают в дистиллированной воде и слегка обсушивают фильтровальной бумагой, проводят через абсолютный спирт или ксилол и заключают в бальзам. Тельца Бабеша-Негри — вишнево-красного цвета, ядра клеток — черные на серо-желтом фоне цитоплазмы.

Кроме указанных методов, для выявления включений мож­но использовать окрашивание по Романовскому-Гимзе. Включе­ния при этом приобретают темно-фиолетовый цвет, цитоплазма — голубой.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 443 | Нарушение авторских прав