АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Краткие теоретические сведения. Одним из методов получения перевиваемых клеток являет­ся отбор клеток первичной культуры с повышенной активностью роста

Одним из методов получения перевиваемых клеток являет­ся отбор клеток первичной культуры с повышенной активностью роста. Отбор осуществляют при регулярной смене среды. Для поддержания отобранных клеток в жизнеспособном состоянии, питательную среду каждые 3...4 дня заменяют свежей. Обычно работа по получению перевиваемых клеток продолжается в тече­ние многих месяцев.

В результате подбора специальных питательных сред, ре­жима культивирования удается адаптировать отдельные клетки к определенной питательной среде и перевивать их очень долго. Клетки, которые приобрели способность к длительному пассированию вне организма, получили название перевиваемых. Таким образом, перевиваемые клетки — это такие клетки, которые перевиваются из одного сосуда в другой при условии замены питательной среды с сохранением потенциальной возможности к дальнейшему размножению.

К перевиваемым клеткам из нормальных тканей относят: штамм L (мышиные фибропласты, 1943), СОЦ (из сердца обезьяны циномольгус, 1957), С-18 (из эмбриональной почки поросенка, 1960), ФК (фибробласты крысы, 1954) и др.

Перевиваемые клетки из опухолевой ткани включают: НеLа (клетки рака шейки матки женщины, 1952), Нер-2 (клетки кар­циномы гортани человека, 1955), Нер-3 (клетки лимфоиднов карциномы человека, 1955) и др.

Разновидностью перевиваемых клеток являются диплоидные клетки. Это морфологически однородные культуры, стабили­зированные в процессе культивирования in vitro, имеющие ограниченный срок жизни (не более 50 пассажей), сохраняющие правильный диплоидный набор хромосом, свойственный исход­ной ткани, свободные от посторонних вирусов и микробов и не обладающие онкогенной активностью.

Необходимо отметить, что для некоторых зоопатогенных вирусов наиболее употребимы определенные виды перевиваемых клеток (табл.2), например, ВНК-21 для вируса ящура, РК-15— для вируса чумы свиней, диареи крупного рогатого скота, ПЭК - для вируса ринотрахеита, ТБ — для вируса герпеса и т.д. Поэто­му ряд видов культур клеток надо уметь сохранять в условиях лаборатории. Основным способом длительного сохранения пере­виваемых клеток является их глубокое замораживание (до минус 70 °С) в присутствии глицерина, сыворотки крови с последую­щим хранением ампул в жидком азоте (минус 196 °С). Все это способ­ствует длительному (до 5...6 месяцев) сохранению клеток.

Перевиваемые клетки имеют следующие преимущества пе­ред первично-трипсинизированными:

1. Они обычно не загрязнены посторонней микрофлорой, как это часто наблюдается в первичных культурах.

2. Большинство их обладает более широким спектром чув­ствительности к вирусам, чем соответствующие первичные куль­туры. Это зависит от происходящих в них физиологических из­менений.

3. Для изготовления перевиваемых клеток требуется мень­ше средств и труда по сравнению с приготовлением первичных культур.

4. Эти клетки чаще, чем первичные культуры, используют­ся для выделения вирусов из материалов, содержащих бактерии, поскольку менее чувствительны к высоким концентрациям анти­биотиков (результат адаптации при пассировании в питательной среде с антибиотиками).

5. Для перевиваемых клеток характерна вирусологическая стерильность (отсутствие спонтанного вирусоносительства).

Вместе с тем, перевиваемые клетки имеют и ряд недостат­ков, которые в известной степени ограничивают их применение. Они склонны к малигнизации, т.е. злокачественному перерожде­нию, независимо от происхождения, требуют постоянного пассирования с использованием свежей среды, подвержены неспецифической дегенерации (изменяется морфология и снижается чувствительность к вирусам).

Таблица 3.

Характеристика основных свойств перевиваемых линий клеток, полученных из органов различных животных

Перевивание клеток производят в следующем порядке:

1. Снятие клеточного монослоя. Растущие клетки довольно прочно прикрепляются к поверхности стекла под слоем питательной среды. Снять их можно механическим путем (соскабливанием). Однако, это грубый прием, ведущий к значительному повреждению клеток. Чаще применяют 0,02%-ный раствор версена. Диспергирующее действие версена объясняется связыванием им двухвалентных катионов, в частности магния и кальция, т.е. тех ионов, которые способствуют прикреплению клеток к стеклу и обеспечивают целостность клеточной культуры. Под действием версена клетки отделяются от стекла, округляются и образуют взвесь. Из сосудов с развившимся клеточным монослоем сливают питательную среду, добавляют 0,5...1 мл подогретого до 37° (раствора версена и выдерживают в термостате 20...30 мин при периодическом покачивании.

2. Отделение клеток. Взвесь клеток в версене помещают в центрифужные пробирки и центрифугируют при 800...1000 об/мин в течение 7...10 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок клеток ресуспендируют в небольшом количестве питательной среды. Подсчет клеток проводят в камере Горяева так же, как и при получении первичных культур.

3. Посев клеток. После подсчета исходную клеточную взвесь разводят ростовой питательной средой до необходимой концентрации. Приготовленную взвесь вносят при помешивании на магнитной мешалке или пипетированием в пробирки или матрасы и закрывают резиновыми пробками. Посевная доза клеток 1 пробирки 80... 100 тыс/мл, матрасы, флаконы — 25...30 тыс/мл. На пробирках восковым карандашом проводят продольную черту (чертой кладут вверх), засеянные клетки культивируют в термостате при 37 °С в течение 3...4 суток до образования сплошного монослоя. Полученный монослой сохраняет при 37 °С жизнеспособность в течение 5...10 суток в зависимости от вида клеток и состава питательной среды. В течение этого срока клетки можно отделить от стекла, подвергнуть транспортировке или использовать для длительного хранения.

Транспортируют клеточные культуры чаще всего авиапочтой в герметически закрытых сосудах. При этом следует избегать резких колебаний температуры, особенно замерзания или перегревания. По мере старения клеток производят пассаж - переносят их в пробирки со свежей питательной средой.

Заражение культуры клеток. Для заражения вируссодержащим материалом отбирают пробирки с наличием сплошного клеточного монослоя, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Питательную среду удаляют, и в каждую пробирку вносят по 0,1...0,2 мл вируссодержащего материала, подлежащей исследованию, и оставляют ее в наклонном положении. После 30...60 мин контакта материала с клетками в пробирки добавляют1…1,5 мл поддерживающей (без сыворотки) среды. Для каждой пробы вируссодержащего материала используют не менее четырех пробирок (4-6) с культурой клеток. Каждое исследование сопровождают контролями:

а) контроль монослоя в норме (4-6 пробирок). В этом случае из пробирок удаляют ростовую питательную среду и заменяют ее поддерживающей;

б) контроль монослоя, инфицированного эталонными штам­мами вирусов (4-6 пробирок). При этом пробирки с культурой клеток заражают известными (эталонными) вирусами;

в) контроль монослоя, контактировавшего с экстрактом аналогичной ткани, не зараженной вирусом. Для этого берут не­зараженную ткань, аналогичную той, где предполагается наличие вируса. Из нее готовят материал и заражают 4-6 пробирок с культурой клеток.

Все пробирки помещают в ящик с наклонным дном (угол 6°) так, чтобы монослой оказался под питательной средой (чертой вверх) и инкубируют в термостате при 37 °С. Клетки ежедневно микроскопируют под малым увеличением микроскопа (объектив х8 или х10), сравнивая культуры, зараженные вирусом, с кон­трольными.

Формы ЦПД. При взаимодействии вирусов с клетками в по­следних наблюдаются различные морфологические изменения, которые обусловливаются рядом факторов, особенно степенью чувствительности клеток культуры к вирусу и условиями среды.

Контакт вирусов с восприимчивыми клетками сопровожда­ется острой или латентной инфекцией и неопластической транс­формацией последних. При инфекции отмечаются деструктивные изменения в зараженных клетках, часто приводящие к их гибе­ли. Все морфологические изменения, возникающие под воздейст­вием вируса, называют цитопатическим действием (эффектом), сокращенно ЦПД (ЦПЭ). При латентной инфекции репродукция вируса в зараженных клетках не приводит их к гибели, и внешне они не отличаются от нормальных (не зараженных).

Первоначальный этап взаимодействия вирусов с клеткой — это изменение некоторых звеньев обмена веществ, которые можно выявить определенными гистохимическими реакциями. Одним из ранних проявлений такого взаимодействия является увеличение размеров ядра (дезинтегративное набухание). Эта реакция неспе­цифична, поскольку она не зависит от биохимического состава и размера вирусов, их биологических свойств. Данное явление ха­рактерно для вирусов, вызывающих как острую, тек и хрониче­скую инфекцию.

Второй этап — специфический. Одна из его особенностей — проявление характерного ЦПД вируса. При этом некоторые виру­сы (аденовирусы и др.) поражают ядра клеток, другие — цитоплазму (вирус гриппа и др.), третьи же разрушают и ядро, и цитоплазму.

При исследовании под микроскопом клеточного монослоя отмечают следующие морфологические изменения при остров инфекции:

а) округление клеток. Они принимают шаровидную форму, отделяются от стекла и свободно плавают в культуральной жид­кости;

б) появление в цитоплазме пораженных клеток мелкой зер­нистости;

в) увеличение в размерах этой зернистости и появление внутриклеточных включений;

г) очаговые скопления округлившихся клеток в виде гроз­дьев винограда;

д) образование гигантских многоядерных клеток — симпластов, синцитиев;

е) появление в монослое клеток "стерильных пятен", т.е. участков без клеток;

ж) полное "сползание" клеток со стекла.

При латентной инфекции вирус в клетках размножается, но не вызывает их видимого разруше­ния. Клетки остаются жизнеспо­собными, однако интенсивность клеточного деления понижается, со временем изменяется их морфоло­гия.

При неопластической трансфор­мации у пораженных клеток образуются плотные фо­кусы трансформации различной величины и формы белого цвета.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 513 | Нарушение авторских прав