АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Краткие теоретические сведения. Культура клеток — это клетки тканей различных органов многоклеточного организ­ма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма (in vitro)

Культура клеток — это клетки тканей различных органов многоклеточного организ­ма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма (in vitro). При этом в пробирках или матрасах образу­ется клеточный монослой. Культуру клеток практически можно получить из любого органа или ткани человека или животного (взрослого или эмбриона). Однако, лучше это удается сделать из эмбриональных органов, так как их клетки еще слабо дифферен­цированы и обладают более высокой потенцией роста.

Главными нововведениями, упростившими культивирование клеток и способствовавшими распространению метода клеточных культур, были: 1) использование антибиотиков» не повреждающих животные клетки, но предотвращающих загрязнение культур бак­териями; 2) получение из карциномы человека линии клеток (HeLa), способных неопределенно долго расти in vitro и воспри­имчивых к большому числу различных вирусов человека (Gey et al„ 1952; Scherer et al., 1955); 3) разработка Иглом (Eagle, 1960) простой питательной среды, поддерживающей размножение клеток многих типов; 4) усовершенствование методов получения клонов из единичных клеток млекопитающих (Puck et al., 1957).

Наличие клеточных культур и метода количественного опреде­ления вирусов путем подсчета образуемых ими бляшек в равной степени стимулировало развитие двух аспектов вирусологии. Во-первых, в результате клинических и эпидемиологических ис­следований были открыты сотни новых вирусов — так много, что некоторые из них до сих пор не удалось связать с какими-либо известными болезнями (Jackson, Muldoon, 1975). Во-вторых, со­здалась возможность производства вакцин в промышленных мас­штабах. К началу 1960-х годов только против полиомиелита было вакцинировано несколько сотен миллионов человек, и теперь во всех странах заболеваемость полиомиелитом резко снизилась. В клеточных культурах были получены и другие вирусные вакци­ны, например противокоревая, и после успеха профилактики по­лиомиелита они получили широкое применение. Методы получения вирусов в больших количествах оказались полезными и для общей вирусологии, они облегчили очистку вирусов.

В вирусологической практике наиболее широко применяют однослойные культуры клеток. Последние, в зависимости от ис­ходного материала, подразделяют на первичные (получают непо­средственно из органов животных и человека) и перевиваемые (адаптируют первичные культуры к условиям жизни в пробирке). Их получают путем обработки кусочков тканей ферментами (трипсин). Последние распадаются на клетки, которые и выращи­вают в виде одного слоя (монослоя) на внутренней поверхности стекла.

В вирусологической практике применяют следующие культуры клеток.

1. Первичные. Их готовят непосредственно перед применением (для длительного культивирования они не пригодны). Их можно получить из различных органов и тканей человека и животных. Однако, лучше это удается сделать из эмбриональных органов. Чаще всего используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы эмбрионов или молодых животных. После соответствую­щей подготовки их измельчают на кусочки размером 1...2 мм и обрабатывают трипсином (такие культуры называют первичнотрипсинизированными). Затем полученную взвесь клеток разли­вают по пробиркам или в другую посуду, заливают питательной средой, инкубируют в термостате и получают монослой клеток. Обычно он формируется через 3...5 дней. Скорость формирования зависит от вида ткани, возраста животного, качества питательной среды, посевной концентрации клеток и других факторов. Пита­тельную среду меняют по мере ее загрязнения продуктами жиз­недеятельности клеток. Монослой сохраняет жизнеспособность в течение 7...21 дня.

Из первичных клеток можно получить субкультуры путем снятия их со стекла раствором версена (или смесью версена и тринсина) и ресуспендирования в новой питательной среде. Суб­культуры получают от 2-5 пассажей и очень редко до 8-10. По­следующие пассажи приводят к изменению морфологии клеток и их гибели.

2. Перевиваемые. Это клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лабораториях их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой при условии замены питательной среды. Получают перевиваемые клетки из первичных культур клеток с повышенной активностью роста путем длительных пересевов в определенном режиме куль­тивирования. Эта работа проводится в течение многих месяцев. Полагают, что механизм происхождения перевиваемых клеток — результат их генетической изменчивости.

Клетки перевиваемых культур имеют одинаковую форму, гетероплоидный набор хромосом (у первичных культур он диплоидный), стабильны в условиях роста в пробирке, некоторые из них обладают онкогенной активностью. Последнее свойство огра­ничивает их использование при производстве вакцин.

Перевиваемые клетки можно получить как из здоровых тканей животных, так и из опухолевых. Примеры таких клеток: ВНК-21 (почка новорожденного хомячка); ППТ (перевиваемая почка теленка); ППО (перевиваемая почка овцы); НеLа — (рако­вая опухоль шейки матки женщины); Нер-2 (карцинома гортани человека); Нер -3 (лимфоидная карцинома человека) и др.

3. Диплоидные. По сути дела это перевиваемые культуры с двойным (правильным) набором хромосом. В первых 50-60 пассажах такие культуры остаются диплоидными и их широко ис­пользуют для решения ряда теоретических и практических задач биологии (приготовление биопрепаратов для человека, выделение онковирусов и др.). Они весьма жизнеспособны, не подвержены морфологическим изменениям, свободны от спонтанного вирусоносительства и т.д.

Подготовка посуды. Качество посуды имеет важное значение для успешного культивирования клеток вне организма. Лучшей является посуда из боросиликатного или натриевого стекла. Посуда должна быть чистой, обезжиренной, не обладать токсическим действием, абсолютно стерильной.

Предложено много способов обработки посуды и в каждой лаборатории выбирают наиболее подходящий из них. При культивировании клеток особенно большие требования предъявляют подготовке и стерилизации посуды, пробок и других материале Во многих случаях неправильная их мойка и стерилизация служат причиной неприкрепления клеток к стеклу или быстрой генерации клеточного монослоя.

При обработке посуды необходимо учитывать высокую чувствительность клеток к токсическому действию солей тяжел металлов. Одним из обязательных условий успешной работы клетками является высокое качество воды. Для ополаскивав посуды используют дистиллированную, а лучше бидистиллированную воду.

Обычно всю посуду, как новую, так и бывшую в употреблении (БУ), помещают в мыльный раствор, а инфицированную — мыльно-феноловый (1% мыльной эмульсии + 5% фенола) на сутки. Затем посуду моют теплой водой и обрабатывают по следующей методике. Погружают на 3 ч в раствор хромпика (на 1л концентрированной серной кислоты добавляют 80 г двухромов кислого калия КзСг207); раствор должен быть желтоват коричневого цвета, если он приобретает зеленое окрашивание значит хромовая кислота восстановилась и раствор непригоден для использования. После обработки в хромпике посуду 5 ч промывают в проточной водопроводной воде, ополаскивают в нескольких сменах дистиллированной воды, сушат, монтируют стерилизуют 1,5...2 ч в сушильном шкафу (170...180 °С). Посуда БУ обрабатывают хромпиком в течение 1 ч и стерилизуют при аналогичных условиях.

Пипетки после работы собирают в банки с дезинфицирующим раствором и выдерживают в них не менее суток, затем удаляют ватные прокладки, промывают хромпиком, водопроводной дистиллированной водой, помещают на некоторое время 96°-ный этиловый спирт, высушивают, монтируют и стерилизую в сушильном шкафу 1,5...2 ч при 170-180 °С.

Новые резиновые пробки содержат токсические для клеток вещества. Для удаления их моют в теплой воде щетками, прополаскивают водопроводной водой, кипятят в 2%-ом растворе NаОН течение 3 мин, снова прополаскивают водопроводной водой, 5 мин кипятят в 1,8%-ном растворе НС1, ополаскивают водопро­водной водой, три раза дистиллированной, сушат на воздухе, монтируют и стерилизуют в автоклаве 1 ч при 0,15 МПа).

Пробки БУ автоклавируют и 1 ч кипятят, моют щетками, прополаскивают водопроводной водой, один раз дистиллирован­ной, кипятят в течение часа в дистиллированной воде, 3 раза прополаскивают в дистиллированной воде, высушивают, монти­руют, стерилизуют в автоклаве.

Инструменты кипятят в дистиллированной воде и погру­жают в стакан со спиртом (стакан должен находиться в боксе). Перед каждой манипуляцией их прожигают на спиртовке.

Солевые растворы. Для культивирования клеток большин­ство питательных сред готовят на сбалансированном солевом рас­творе, для которого необходимы высокоочищенные препараты, так как следы ряда примесей (свинец, ртуть и другие тяжелые металлы) токсичны для клеток. Солевые растворы готовят на бидистиллированной воде. Они обеспечивают сохранение рН, осмо­тического давления в клетках, соответствующую концентрацию необходимых неорганических веществ. Лучшими из них являют­ся растворы Хенкса и Эрла. Эти растворы — обязательный ком­понент любой питательной среды.

Раствор Хенкса: На 1 л бидистиллированной воды берут

NаС1 — 8,0 г, КСl — 4,0 г, MgSO₄ • 7Н₂О — 2,0 г, СаС1₂ — 1,4 г, КН₂Р0₄—0,6 г, глюкозы — 10 г, 0,2%-го фенолрота— 4,0 мл, Nа₂НР0₄ — 0,6 г.

Раствор Эрла: на 1 л бидистиллированной воды добавляют— NаС1 — 6,8 г, КС1— 0,4 г, СаС1₂—0,2г, MgSO₄ —0,1 г, NaH₂PO₄—0,125 г, NaHCO₃—2,2 г, глюкозы— 1,0г.

Для определения в солевых растворах и питательных средах концентрации водородных ионов (рН) применяют индикатор фе­ноловый красный (0,002%). Он не оказывает токсического воз­действия на клетки и вирусы. При сдвигах рН в щелочную сторону растворы принимают красно-малиновую окраску, в кислую— желтую. При нейтральном значении рН (7,2...7,4) цвет среды оранжево-красный. Для регулирования рН солевых раство­ров и питательных сред используют 7,5%-ный раствор бикарбо­ната натрия NaHCO₃ и 3% -ный раствор уксусной кислоты СН₃СООН. Эти растворы готовят на бидистиллированной воде, стерилизуют кипячением и хранят в холодильнике при 4...6 °С не более месяца.

Чтобы получить однослойную культуру клеток, применяют протеолитические ферменты, разрушающие цитоплазматические мостики между клетками. К таковым относятся трипсин, панкреатин, папаин и др. Наиболее часто используют трипсин в виде 0,25%-ного раствора на фосфатном буфере. Хранят его в замороженном состоянии 6...8 месяцев.

При пересеве перевиваемых клеток с целью отделения их от стекла используют версен (натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты). Он оказывает на клетки более легкое действие, чем трипсин. Механизм действия заключается в том, что он всту­пает в реакцию со стеклом, образуя промежуточное соединение, которое механическим путем отделяет клетки друг от друга.

Питательные среды. Различают искусственные (полусинте­тические и синтетические) и естественные питательные среды.

Естественные питательные среды — это биологические жидкости (сыворотка крови, эмбриональный экстракт, асцитическая жидкость, коровья амниотическая жидкость, тканевые экс­тракты и др.).

Питательные среды из естественных компонентов применяют редко, главным образом для выращивания вновь изо­лированных тканей в начале культивирования и для поддержа­ния очень прихотливых тканей животных.

К полусинтетическим питательным средам относят гемогидролизаты, гидролизат лактальбумина, аминопептид и др.

Лучшей искусственной питательной средой является синте­тическая среда 199. Она содержит 60 компонентов: 10 аминокис­лот, 17 витаминов, 8 минеральных солей, 10 компонентов, вхо­дящих в состав нуклеиновых кислот и др.

Кроме того, среды подразделяются на ростовые и поддер­живающие. Ростовые применяются в 1-ой фазе культивирования клеток. Они богаты питательными веществами и способствуют активному размножению клеток (например, 5%-ый гемогидролизат + 10% бычьей сыворотки). Поддерживающие среды приме­няют во 2-ой фазе культивирования клеток — после заражения культуры клеток вирусами. Они поддерживают жизнеспособность клеток. Из поддерживающих сред обычно исключают сыворотку.

Для уничтожения микрофлоры перед использованием в сре­ды добавляют пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (50 ЕД/мл), тетрациклин (100 ЕД/мл), устанавливают рН 7,2...7,4; в ростовые среды, кроме того, вносят 10% бычьей сыворотки.

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо:

1. Ознакомиться с солевыми растворами и питательными средами, рецептурой их приготовления.

2. Отработать технику подготовки посуды для стерилиза­ции;

3. Провести регулировку рН в одном из растворов, пита­тельной среде (раствор Хенкса, 0,5%-ный гемогидролизат или др.).

Примерный план занятия (2 ч)

1. Контрольный опрос.

2. Объяснения преподавателя.

3. Демонстрация растворов Хенкса, Эрла, трипсина, версена, питательных сред 199, Игла, гидролизаталактальбумина и др, посуды для культивирования клеток.

4. Самостоятельная работа студентов.

5. Подведение итогов занятия.

6. Задание к следующему занятию.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 999 | Нарушение авторских прав