АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Краткие теоретические сведения. РКЭ вначале овоскопируют, на скорлупе отмечают границу воздушной камеры

РКЭ вначале овоскопируют, на скорлупе отмечают границу воздушной камеры. Её поверхность обрабатывают спиртом и обжигают. Стерильными ножницами срезают скорлупу на 2...3 мм выше границы воздушной камеры, Разрывают подскорлупную и хорион-аллантоисную оболочки, асептически извлекают эмбрион и помещают его в чашку Петри. Затем у эмбриона удаляют лапки, крылья, голову и обязательно внутренние органы. Оставшуюся часть (кожно-мышечный мешок) промывают буферным раствором Хенкса с антибиотиками. После трехкратного отмывания эмбрион измельчают ножницами на кусочки размерами 2...3 мм. Измельченную ткань 3 раза отмывают в растворе Хенкса с антибиотиками от слизи и элементов крови и переносят в колбу для трипсинизации. Ткань в колбе заливают двойным объемом 0,25%-ного раствора трип­сина, подогретого до 37 °С, и вносят стериль­ный магнит. Колбу ставят на магнитную ме­шалку. Раствор трипсина и механическое воздействие вращающегося магнита способствуют растворению межкле­точного вещества, разделению клеток и пере­ходу отдельных из них в раствор. Первый этап трипсинизации продолжается 3...5 мин. Затем отделившиеся клетки вместе с трипси­ном сливают в центрифужные пробирки и помещают в кювету со льдом, чтобы ограни­чить дальнейшее воздействие трипсина на клетки. К оставшейся ткани добавляют вто­рую порцию трипсина, и колбу снова поме­щают на магнитную мешалку. Скорость вращения регулируют так, чтобы не наступало вспенивания содержимого колбы. Трипсинизацию проводят 3-4 раза, до полного истощения ткани, кото­рое определяют по белесоватому оттенку кусочков и их разбуха­нию. После окончания трипсинизации полученную взвесь клеток 10...15 мин подвергают центрифугированию при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок клеток ресуспензируют в питательной среде (1:10), подогретой до 37 °С, и сливают в колбу через 3-4 слойный марлевый фильтр. После перемешивания суспензии клеток берут две ее пробы по 0,5 мл. К каждой из них добавляют по 0,5 мл 0,1%-го кристаллвиолета в 0,1 N растворе лимонной кислоты. После перемешивания каплю суспензии помещают в счетную камеру Горяева и подсчитывают клетки, имеющие хорошо заметное ядро и неповрежденную ци­топлазму. Клетки подсчитывают не менее как в трех больших квадратах камеры. Из полученных данных находят среднее арифметическое. Количество клеток в 1 мл определяют по фор­муле

а х 4000 х б

Х = --------------------

в

где а — среднее количество клеток в малом квадрате; б — степень разведения; в — количество подсчитанных малых квадратов.

Точный подсчет клеток необходим, поскольку качественный монослой можно получить лишь при определенной оптимальной посевной дозе. В соответствии с результатами подсчета к суспензии добавляют необходимое количество питательной среды, чтобы в 1 мл содержалось 250...300 тыс. клеток. К пи­тательной ростовой среде добавляют 10% бычьей сыворотки и антибиотики — пенициллин, стрептомицин, тетрациклин (по100ЕД/мл), устанавливают рН 7,2...7,4.

Для культивирования клеток в каждую пробирку засевают 1-15 мл суспензии; во флаконы емкостью 100 мл — 20 мл, 250 мл— 40 мл, 1л — 100 мл клеточной взвеси. Флаконы и пробирки плотно закрывают стерильными резиновыми пробками.

На пробирках восковым карандашом проводят продольную черту, укладывают их чертой вверх ящики с наклонным дном (угол 6°) и помещают в термостат при 37 °С.

Клетки фиксируются на внутренней поверхности пробирки. Через 24...48 ч образуется сплошной слой клеток, располагающихся 1 один ряд (монослой).

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 344 | Нарушение авторских прав