АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Краткие теоретические сведения. В настоящее время максимально ранняя диагностика возбудителей инфекций является важнейшим принципом контроля за их распространением.

В настоящее время максимально ранняя диагностика возбудителей инфекций является важнейшим принципом контроля за их распространением.

Обнаружение и идентификация возбудителей инфекционных заболеваний животных и птиц представляет собой одну из наиболее важных задач ветеринарной бактериологии и вирусологии. Решение этой задачи обеспечивается богатым арсеналом методических приемов, - начиная от клинических методик вирусологического и бактериологического тестирования и кончая иммунохимическими и молекулярно-биологическими методами. В каждом случае характер и сложность диагностических приемов зависят от биологии возбудителя инфекции. В отличие от растений и животных микроорганизмы как правило лишены отличительных морфологических и поведенческих свойств, позволяющих определять их принадлежность к определенным таксонам. Поэтому для идентификации патогенных микроорганизмов широко привлекаются биохимические, серологические и молекулярно-генетические подходы. Биохимический анализ выделенного возбудителя в большинстве случаев дает возможность правильно установить родовую или видовую его принадлежность. Однако существенным недостатком данного подхода является требование предварительного выделения возбудителя в виде чистой культуры. Некультивируемость микроорганизмов - главная причина, по которой культуральный метод все более и более теряет свои позиции по мере появления альтернативных подходов. При этом под некультивируемостью мы понимаем как невозможность на современном уровне развития микробиологии подобрать условия культивирования для большинства микроорганизмов, существующих в природе (по некоторым данным эта цифра может достигать 99%), так и невозможность высеять хорошо культивируемый микроорганизм из какой-либо биологической среды, содержащей ингибиторы его размножения. Кроме того, целый ряд клинически важных бактериальных возбудителей животных может плохо культивироваться из-за широкого применения в современной ветеринарной лечебной практике антибиотиков широкого спектра действия. Помимо этого, для многих возбудителей культуральный метод представляет собой трудоемкую, длительную и дорогостоящую процедуру. В то же время традиционные серологические тесты: РСК, РДП, РГА, а порой и наиболее перспективные методы диагностики - иммуноферментный анализ (ИФА) и иммуноблотинг (ИБ), оказываются фактически неэффективными или принципиально неприемлемыми для выявления инфекционных возбудителей по причине, главным образом, их низкой чувствительности.

Поэтому в последнее время все большее распространение получают новейшие методы диагностики, основанные на обнаружении в исследуемых клинических образцах специфических нуклеотидных последовательностей генома микроорганизмов. Генодиагностика — это комплекс методов, которые позволяют обнаруживать гены или последовательности нуклеиновой кислоты, специфичные для определения вида возбудителя инфекционного заболевания. Геноди­агностика — относительно новый раздел диагностики, возникший гораздо позже методов, основанных на микробиологических и иммунологических принципах. Поэтому возможности и области применения этого ме­тода еще не так широко известны микробиологам и эпизоотологам. В связи с этим целью данного обзора является рассмотрение как современного состояния генодиагностики, так и областей ее применения. Это, по нашему мнению, позволит показать, что генодиагностика возникла не для того, чтобы потеснить имеющие­ся микробиологические и иммунологические методы, а, наоборот, чтобы дополнить их, позволяя решать те за­дачи диагностики инфекционных заболеваний, которые ранее были не доступны классическим методам.

Создание всего нового, в том числе и новых методов диагностики, возможно только на основе фундамен­тальных разработок. Становление и совершенствова­ние генодиагностики тому яркий пример. Начиная с 1953 г., когда Дж. Уотсон и Ф. Крик опубликовали ра­боту, посвященную структуре ДНК, стало ясно, что ос­новной принцип, лежащий в основе всего живого – принцип комплементарности. Однонитевая цепь ДНК для образования двунитевого комплекса взаимодейству­ет с цепью ДНК, обладающей комплементарной после­довательностью. С этих пор данный принцип стал ши­роко и успешно использоваться для решения различ­ных, более частных проблем, в том числе и для диагно­стики патогенных микроорганизмов.

До конца 80-х годов реакция гибридизации ДНК с ДНК была основой генодиагностики. Для проведения этой реакции необходимо было располагать клониро­ванной последовательностью ДНК, которую использо­вали в качестве молекулярного зонда. Молекулярный зонд должен быть специфичным по отношению к ДНК тестируемого микроорганизма, а также желатель­но быть частью гена, кодирующего синтез одного из факторов патогенности. При использовании молеку­лярного зонда, удовлетворяющего этим требованиям, можно не только идентифицировать микроорганизм, но и давать заключение о его вирулентном потенциале и эпидемиологической значимости, что особенно важно при исследовании микроорганизмов, выделяемых из объектов внешней среды.

Использование молекулярного зондирования позво­лило в значительной степени изменить ряд представле­ний о диагностике инфекционных заболеваний. Было доказано, что тестирование генов факторов патогенно­сти во многих случаях более информативный подход по сравнению с исследованием различных фенотипических свойств, таких как определение серотипа, фаготипа, способности агглютинироваться в присутствии спе­цифических сывороток, которые далеко не всегда отра­жают корреляционные связи с вирулентностью иссле­дуемого микроба.

Однако метод генодиагностики, основанный на ре­акции гибридизации ДНК с ДНК, не отличается высокой чувствительностью и позволяет обнаруживать 10⁴-10⁵ мишеней (это могут быть бактериальные клетки, вирусные частицы или очищенная нуклеиновая кисло­та) в пробе. В связи с этим данный подход является ма­ло информативным при диагностике тех инфекцион­ных состоянии, при которых концентрация микробов ниже порога чувствительности метода, а сами микробы в силу тех или иных причин не размножаются в лабора­торных условиях. С такими ситуациями микробиологам приходиться сталкиваться повсеместно: например при диагностике хронических инфекционных состоянии, обусловленных персистенцией бактерий или вирусов. Те же трудности приходится преодолевать при иденти­фикации практически всех внутриклеточных парази­тов, таких как вирусы, риккетсии, хламидии, микоплазмы, требующих для своего культивирования или очень сложных питательных сред, или же клеточных, или тка­невых культур.)

Следующим шагом фундаментальной науки — моле­кулярной биологии гена — было создание способа ис­следования, получившего название полимеразной цеп­ной реакции (ПЦР), позволяющего не только преодо­левать вышеперечисленные трудности, но и открываю­щего новые возможности при лечении и эпидемиологи­ческом анализе инфекционных заболеваний.

Принцип ПЦР был описан в 1986 г. К. Мullis, полу­чившим за это Нобелевскую премию в 1993 г. В основе этого метода лежит многократное копирование с помо­щью фермента ДНК-полимеразы определенного фраг­мента ДНК, который является маркерным для данного вида. Механизм копирования таков, что комплементар­ное достраивание нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определен­ных стартовых блоках — коротких двунитевых участках. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют затравки, представляющие собой спе­циально синтезированные in vitro олигонуклеотиды длиной около 20 нуклеотидов, называемые праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекает только между ними. В результате проис­ходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента по формуле 2ⁿ, где п — чис­ло циклов амплификации. Поскольку праймеры входят в состав амплифицируемого фрагмента, его размер оп­ределяется числом олигонуклеотидных пар между 5'-концами праймеров. Обычно размер фрагмента состав­ляет несколько сотен нуклеотидных пар.

Построение новых ДНК нитей из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов осуществляет фермент термоста­бильная ДНК-полимераза, называемая Таq-полимеразой. Процесс амплификации заключается в повторе­нии циклов амплификации, состоящих из денатурации ДНК (1 мин), отжига праймеров (1—2 мин) и построе­ния фрагмента (1—2 мин). В результате 30—35 циклов амплификации синтезируется 10⁸ копий фрагмента, что делает возможным визуальный учет результатов после электрофореза в агарозном или акриламидном геле. Использование термостабильной ДНК-полимеразы по­зволило автоматизировать процесс амплификации с по­мощью специального прибора, называемого термоциклером. Этот прибор автоматически осуществляет смену температур согласно заданной программе и числу цик­лов амплификации.

Таким образом, ПЦР аналогична росту бактерий на искусственных питательных средах — процессу биоло­гической амплификации, при которой одна микробная клетка, образуя видимую колонию, амплифицируется в 10⁵—10⁶ раз, давая возможность определить свойства бактерии, манипулируя уже с целой колонией. Как и питательные среды, которые могут быть селективны­ми, поддерживающими рост только одного микроорга­низма, или обогатительными, дающими возможность размножаться широкому кругу микробов, так и прайме­ры, определяющие специфичность ПЦР, могут быть строго видоспецифичными или с их помощью можно выявить целые роды или семейства микроорганизмов. Но в то же время ПЦР имеет принципиальное преиму­щество перед культуральными методами. Диагностиче­ские потенции ПЦР не ограничены способностью мик­роба расти на искусственных средах или в культуре клеток. Поэтому основное преимущество ПЦР перед культуральными методами состоит не в высокой чувст­вительности ПЦР-метода (так как чувствительность этих методов сопоставима), а в способности идентифи­цировать и определять свойства тех микроорганизмов, которых не удается по тем или иным причинам размно­жать в лабораторных условиях. Здесь уместно отме­тить, что идентификационные тест-системы, основан­ные на ПЦР, разрабатываются для микроорганизмов с известными к данному моменту последовательностями ДНК в интересующих генах.

Наивысшая чувствительность ПЦР обычно достига­ется при работе с чистой культурой микроба или, что еще лучше, с очищенной нуклеиновой кислотой. Эта чувствительность автоматически не трансформируется в чувствительность метода при работе с клиническим ма­териалом. На успех определения при работе с этим ма­териалом влияют такие факторы, как методика приго­товления образца, возможное присутствие ингибитора фермента, осуществляющего амплификацию, объем об­разца при низких концентрациях тестируемых молекул.

Наибольшее внимание среди этих методов привлекает полимеразная цепная реакция (ПЦР) в основе которой лежит многократное повторение циклов удвоения (амплификация) специфического участка нуклеотидной последовательности. Главное достоинство метода - очень высокая чувствительность: в результате амплификации концентрация специфической олигонуклеотидной последовательности в реакционной пробе возрастает в десятки миллионов раз. За последние 10 лет достигнут зна­чительный прогресс в изучении молеку­лярной основы наследственных болез­ней и в их диагностике с помощью молекулярного анализа ДНК- В первую очередь это относится к болезням, кото­рые вызваны мутацией в одном гене (моногенным). Каждый год увеличи­вается список наследственных болезней, которые могут быть выявлены методами анализа последовательности нуклеино­вых оснований хромосомной ДНК.

Появилась возможность с помощью исследования образцов ДНК поставить диагноз наследственного заболевания еще до появления клинических симпто­мов или в пренатальный период. Это позволяет выявить носителей мутантного гена при аутосомно-рецессивных бо­лезнях, а также распознать фенотипически сходные, но генетически различ­ные заболевания. В настоящее время расширяется сфера применения этих методов. Помимо диагностики болезней с установленным типом наследования, они начинают использоваться для изучения и мультифакториальных заболеваний (коро­нарная болезнь сердца, сахарный диа­бет, опухоли и др.), а также для иден­тификации личности, установления отцовства и др.

Особую диагностическую ценность ДНК-анализ приобретает при тех наследственных болезнях, при которых неизвестен биохимический дефект, ле­жащий в их основе, и которые поэтому не могут быть выявлены тради­ционными методами лабораторной диагностики. Кроме того, этот метод практически незаменим в тех случаях, когда патологический ген оказывает свое действие только в тканях, которые недоступны для исследования (мозг, печень).Ключом к расширению клиническо­го применения достижений современной молекулярной генетики являются не только разработка методов рекомбинантной ДНК, но и значительное упро­щение технологии проведения ДНК-анализа, повышение чувствительности, быстроты и надежности методов с их последующей автоматизацией. Остановимся теперь более подробно на основных этапах технологии анализа.

Получение и хранение ДНК. Геномную ДНК выделяют с помощью многоступенчатых методов из тканей, содержащих ядерные клетки, в том чис­ле из лимфоцитов периферической кро­ви, лимфобластоидных клеточных ли­ний, а также из амниоцитов и ворсин хориона плода, полученных путем биопсии. Кровь для исследования бе­рут в количестве около 10мл с анти­коагулянтом: цитратом, глюкозоцитратным раствором (глюгициром) или ЭДТА. В большинстве лабораторий ДНК выделяют из взятых образцов в тот же день, но их можно и хранить при температуре —20°С. Первым этапом анализа ДНК является ее экстракция из тканей по стандартному методу. Клетки крови (или ворсин хориона) гемолизируют, обрабатывают протеиназой К в течение ночи для расщепления белков, экстра­гируют сопутствующие вещества фено­лом и хлороформом и осаждают нуклеиновые кислоты этанолом. Методы экстракции ДНК постоянно совершенствуются, разрабатываются различные модификации, направленные на ускорение и повышение эффектив­ности методов, а также исполь­зование менее вредных для исследо­вателя реактивов.

Количество и чистота препарата ДНК оцениваются спектрофотометрически. Экстрагированная ДНК стабильна и может храниться неопределенно долгое время. Это имеет большое зна­чение, так как образцы от людей с генетическими заболеваниями могут быть собраны и сохранены для будущих сопоставлений при обследовании дру­гих членов семьи, а также для про­ведения повторных исследований после получения ДНК-проб нового поколения. Обычно образцы ДНК дублируются и хранятся раздельно в двух морозильниках. Хранение ДНК обеспечивает возможность ДНК-диагностики в семьях, в которых по­жилые или страдавшие наследствен­ными заболеваниями родственники умерли до того, как стало возможным предсказательное тестирование. В случаях, когда пораженные родствен­ники уже умерли и ДНК лейкоцитов недоступна для анализа, оказалось возможным использовать заморожен­ную ткань мозга, взятую на аутопсии.

Для радиоизотопного анализа по Саузерну обычно требуется 5—10 мкг геномной ДНК, что составляет около 2-10^–18 мол. Такое количество ДНК присутствует приблизительно в 10⁶ ядерных клеток, которые могут быть выделены менее чем из 1 мл крови, а в случае пренатальной диагностики — из биоптата ворсин хориона или из амниоцитов. Еще меньшее, крайне незначительное количество ДНК необходимо в тех случаях, когда анализу предшествует амплификация (умножение) участка ДНК-мишени с помощью недавно раз­работанного метода, использующего повторные циклы полимеразной цепной реакции (ПЦР).

В настоящее время используется несколько спосо­бов подготовки образца для проведения ПЦР. Про­цедура подготовки пробы включает лизис микроба и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разруше­ния микробной клетки используют простое кипячение, замораживание—оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода, как правило, диктуется природой микроба, а точнее природой его клеточной стенки. Для экстракции ДНК используют два основных метода. Во-первых, классическую проце­дуру фенольно-хлороформной экстракции. При этом достигается хорошая очистка ДНК и в первую очередь от ингибиторов Таq-полимеразы, но неизбежны боль­шие потери нуклеиновой кислоты, особенно заметные при работе с образцами небольшого объема с низкой концентрацией инфекционного агента. Другой способ, применяемый для очистки нуклеиновой кислоты, осно­ван на использовании нуклеосорбентов. Подготовка материала с применением нуклеосорбента занимает меньше времени и более проста в исполнении, хотя не всегда может гарантировать удаление возможных инги­биторов.

Зная возможности и преимущества этого метода, сформулируем те направления исследований в инфек­ционной патологии, в решении которых ПЦР начина­ет играть ведущую роль:

— диагностика хронических инфекционных состоя­ний, обусловленных персистенцией бактерий или виру­сов, — наиболее очевидная область применения ПЦР в диагностических целях;

— ПЦР — незаменимый инструмент при идентифи­кации и молекулярно-генетических исследованиях практически всех внутриклеточных и мембранных па­разитов, таких как вирусы, риккетсии, хламидии, микоплазмы;

— ПЦР является наиболее эффективным способом выявления и изучения возбудителей сапронозов, кото­рые, находясь во внешней среде в "некультивируемом" состоянии, способны там сохраняться, переживая не­благоприятные внешние условия в межэпидемические периоды;

— ПЦР позволяет проводить определение антибиотикорезистентности у медленно растущих и труднокультивируемых бактерий;

— технология ПЦР коренным образом изменила способы маркирования штаммов для целей эпидемио­логического анализа, тем самым расширив его возмож­ности.

Теперь обратимся к конкретным примерам, которые показывают, как технология ПЦР позволяет решать пе­речисленные выше задачи.

На настоящий момент преимущество ПЦР-анализа перед "золотым стандартом" (так красиво называют культуральный метод выявления бактерий и вирусов) состоит в следующем: 1) более высокая частота обнаружения микроба, превышающая культуральный метод на 6— 7%. Эти различия объясняются возможной гибелью микроба при хранении и транспортировке, тогда как ПЦР способна обнаруживать и нежизнеспособные фор­мы микроорганизма; 2) время, необходимое для обна­ружения микроба культуральным методом, составляет около 4-6 сут., тогда как при использовании ПЦР через 4—5 ч; 3) использование технологии ПЦР позволяет проводить определение инфекционного агента в образцах, взятых неинвазивным путем.

Одной из наиболее интересных сфер приложения ПЦР в эпидемиологии является использование этой технологии для мониторинга объектов внешней среды. Помимо решения чисто прикладных задач (усовершен­ствование методик обнаружения возбудителей в пробах воды, почвы и т. д.) в этой области, ПЦР является важ­ным инструментом для получения фундаментальной информации о способах поддержания жизнеспособно­сти микроорганизмов вне связи с организмом животно­го или человека.

За последние 5—7 лет накоплен достаточно обшир­ный материал, свидетельствующий о способности мно­гих видов патогенных бактерий переходить в так назы­ваемое некультивируемое состояние. Формирова­ние некультивируемых форм бактерий сопровождается глубокими перестройками метаболизма и изменением морфологии бактериальной клетки. В результате клетки бактерий, сохраняя жизнеспособность, перестают де­литься и, будучи перенесены на плотную питательную среду, не формируют колоний. Однако переход в не­культивируемое состояние не является необратимым, и под воздействием изменяющихся условий внешней сре­ды некультивируемые клетки бактерий могут восста­навливать способность к пролиферации.

Очевидно, что некультивируемые формы бактерий нельзя выявить традиционными микробиологическими приемами, включающими посевы из исследуемых об­разцов на плотные питательные среды. Микроскопия с использованием витальных красителей в данном слу­чае может служить лишь инструментом изучения фор­мирования некультивируемых форм в лабораторном эксперименте. Показано, что переходить в некультиви­руемое состояние могут возбудители многих заболева­ний человека. Переход в некультивируемое состояние представляет собой способ поддержания жизнеспособ­ности в неоптимальных для активного роста условиях. Эта способность обнаруживается в первую очередь у патогенных бактерий—сапрофитов. Диагностика забо­леваний, вызванных многими из подобных инфекцион­ных агентов, успешно обеспечивается традиционными методами. Однако единственным в настоящее время методическим подходом, способным доказать присутст­вие в образце некультивируемых форм возбудителя, яв­ляется ПЦР. При использовании такого подхода проде­монстрировано, что эндемичность ряда природных оча­гов объясняется способностью возбудителей сапронозов сохраняться в объектах внешней среды в некультиви­руемом состоянии. Это положение, по нашему мнению, чрезвычайно важно для всей системы эпизоотоологического надзора, так как дает возможность, ис­пользуя технологию ПЦР, выявлять потенциально опасные штаммы возбудителей сапронозов раньше, чем они попали в человеческую популяцию и вызвали эпидемиологическое осложнение.

Большое значение приобретает метод ПЦР при кон­троле продуктов питания. Таким образом, технология ПЦР является мощным инструментом, обеспечивающим возможность фунда­ментального изучения хронических инфекционных процессов и экологии возбудителей инфекционных за­болеваний.

ПЦР — это метод амплификации in vitro, с помо­щью которого в течение нескольких часов можно выде­лить и размножить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходную в 10⁸ раз. При амплификации с помощью ПЦР используют два олигонуклеотидных праймера (затравки), фланкирую­щие участок ДНК, специфический для определяемого возбудителя, процесс амплификации заключается в по­вторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последо­вательностями и последующей достройки полинуклеотидных цепей с этих праймеров ДНК-полимеразы. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы протекает только между ними, удваивая количество копий этого участка ДНК. Амплифицированный участок именуют "ампликоном". В ре­зультате происходит экспоненциальное увеличение ко­личества специфического фрагмента приблизительно по формуле 2ⁿ, где n — число прошедших циклов ам­плификации. Поскольку праймеры физически включа­ются в концы продуктов застройки, они детерминиру­ют сам продукт реакции — фрагмент ДНК, равный по длине расстоянию между 5-концами праймеров на ис­следуемом участке ДНК. Процесс амплификации идет эффективно, если использовать термостабильную ДНК-полимеразу, выделенную из бактерии Thermus aquaticus (Tag). К достоинствам указанной полимеразы относится то, что нет необходимости ее замены после каждого цикла, а также сравнительно высокий темпера­турный оптимум детерминируемой ею реакции (70— 75°С). Праймеры для ПЦР обычно имеют длину, как правило, около 20 нуклеотидов.

Рассмотрим основные характеристики ПЦР-анализа.

Надежность — защищенность анализа от ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Ложноположительный результат анализа является следстви­ем заражения образца или реактивов ДНК исследуемо­го образца или, что бывает чаще, амплификатом. В свя­зи с этим необходимо пространственное разделение ди­агностической лаборатории как минимум на три блока: в одном из них проводить приготовления ДНК-образ­ца, в другом — постановку амплификации и в третьем — электрофорез и индикацию. Перенос реактивов и оборудования между блоками должен быть исключен. Достаточным контролем является отсутствие сигнала для образца с заведомо отсутствующей ДНК исследуе­мого образца. Ложноотрицательный результат может быть вызван тривиальными причинами: недостаточной чувствительностью реакции, ошибками оператора в вы­делении ДНК и проведении амплификации и др. По­этому в каждой серии анализов присутствует положи­тельный контроль — образец с заведомо присутствую­щей матрицей для данных праймеров, например хромо­сомная ДНК искомого возбудителя инфекции. Кроме того, причиной ложноотрицательного результата может быть присутствие в образце ингибиторов реакции. При использовании всех указанных контролей, надежного оборудования и жестко стандартизованных реактивов метод ПЦР высоконадежен.

Чувствительность анализа характеризуется очень низкой концентрацией клеток или вирусных частиц в пробе, дающей положительный результат анализа, и определяется эффективностью методики выделения ДНК возбудителя, чувствительностью собственно ПЦР и чувствительностью выбранного метода индикации. Метод выделения ДНК должен быть еще дешевым и простым. ПЦР при оптимальных условиях крайне чув­ствительна: в модельной системе в сочетании с блотгибридизацией с радиоактивно меченным ДНК-зон­дом удается зарегистрировать 3—5 копий генома цитомегаловируса в пробе. Достигаются оптимальные усло­вия подбором температурно-временного режима, кон­центрации ионов магния, праймеров и фермента в ре­акционной смеси, применением при необходимости "горячего старта" — добавления фермента в реакцион­ную смесь, уже прогретую до температуры плавления ДНК. Достигнуть предельно высокой чувствительности при самых простых методах индикации позволяет и четырехпраймерная амплификация (ЧПА). ЧПА реализу­ет принцип "русской матрешки": вначале пара "внеш­них" праймеров запускает синтез первого ампликона, затем после нескольких циклов пара праймеров, ком­плементарных внутренним последовательностям перво­го ампликона, запускает синтез второго, меньшей дли­ны. В модельных системах при диагностике цитомегаловируса ЧПА в сочетании с электрофорезом в ПААГ и окрашиванием бромистым этидием дает возможность уверенно регистрировать порядка 10 геномов в пробе. Предел чувствительности ПЦР-диагностикума инфек­ционных заболеваний (при условии использования 100 мкл клинического образца) в 100—1000 возбудите­лей в 1 мл. Такой чувствительности могут достигать только культуральные методы диагностики.

Важным параметром является избирательность ана­лиза — способность диагностикума выявлять возбуди­телей инфекции конкретного вида на фоне любых дру­гих микроорганизмов, вирусов и клеток организма хо­зяина. С этой точки зрения возможности ПЦР-диагно-стикумов уникальны: соответствующим образом вы­бранная последовательность ДНК мишени (выбор праймеров) позволяет в зависимости от целей диагно­стикума выявлять вид и отдельные штаммы микроорга­низмов.

Уникальность метода обусловлена тем, что он обла­дает самой высокой чувствительностью и специфично­стью, превосходящими получаемые культуральным ме­тодом. Учитывая продолжительность и трудоемкость процедуры выращивания культуры клеток (до месяцев), преимущества ПЦР (5—8 ч) очевидны. Специалистами фирмы проведена сравнительная оценка эффективно­сти метода ПЦР по сравнению с традиционными мето­дами, показаны преимущества и ограничения примене­ния метода в клинической практике. Так, проведено сравнение результатов ПЦР-анализа и нерадиоизотопного гибридизационного анализа клинических образцов на содержание хламидия трахоматис и уреаплазма уреа­литикум с использованием в качестве метки комплек­сов платины и показано хорошее совпадение результа­тов, полученных указанными методами ДНК-диагно­стики. Исследованиями в ряде ведущих лабораторий мира на примере обнаружения в биологических пробах хламидия трахоматис показано, что методом ПЦР или лигазной цепной реакции определяют на 10—20% боль­ше положительных проб, чем культуральным методом или подтверждающими некультуральными методика­ми. Методом ПЦР в клиническом материале (соскоб клеток эпителия) нами обнаружено наличие двух биоваров уреаплазма уреалитикум. Важным параметром яв­ляется избирательность анализа — способность диагно­стикума выявлять возбудителей инфекции конкретного вида на фоне любых других микроорганизмов, вирусов и клеток организма хозяина. С этой точки зрения воз­можности ПЦР-диагностикумов уникальны: соответст­вующим образом выбранная последовательность ДНК мишени (выбор праймеров) позволяет в зависимости от целей диагностикума выявлять вид и отдельные штам­мы микроорганизмов.

Забор материала. Как правило, это соскоб эпители­альных клеток со слизистой цервикального канала или уретры, могут использоваться слюна, выделения, моча, у детей — соскоб с миндалин. Собранный биоматериал желательно сразу использовать для анализа. Хранить биоматериал можно при —20°С не более 0,5 мес. Со­скоб из цервикального канала желательно брать в сере­дине менструального цикла. У лиц, принимающих ан­тибиотики, уросептики, наркотические вещества, взя­тие биологического материала для анализа следует про­изводить через 14 сут после их отмены.

ЗАО "ВСМ" производит набор лабораторных изде­лий и поставляет "под ключ" диагностические центры для ПЦР-диагностики, обеспечивает гарантийное и постгарантийное обслуживание оборудования, прово­дит обучение методу. Минимальный набор состоит из следующих приборов:

1. Термостат, программмируемый для проведения ПЦР-анализа "ВСМ" (рекомендован к применению в медицинской практике Минздравом РФ), — прибор для проведения амплификации (умножения) детекти­руемого участка генома возбудителя заболеваний. При­бор рассчитан на одновременный анализ 24 образцов (из которых один положительный и один отрицатель­ный контроль) клинического материала.

2. Термостат 2Т001 ("ВСМ") — предназначен для термостатирования биологических проб.

3. Настольная миницентрифуга (Элми) — предна­значена для подготовки проб исследуемого клиниче­ского материала. Обеспечивает максимальную частоту вращения ротора 14 000 об/мин.

4. Микроцентрифуга-вортекс МВ01 ("ВСМ") — предназначена для низкооборотного центрифугирова­ния и ресуспендирования биологических проб.

5. Источник питания низковольтный "ИП-01" ("ВСМ") — предназначен для серийного анализа биоло­гических образцов при помощи электрофореза при двух фиксированных значениях напряжения.

6. Камера для электрофореза КЭ-01 ("ВСМ") — предназначена для проведения исследования биомеди­цинских проб методом электрофореза в агарозном геле.

7. Трансиллюминатор ТР-01 ("ВСМ") — источник ультрафиолетового излучения, предназначен для иссле­дования люминесцирующих следов в жидкостях и ге­лях.

В состав набора входят микродозаторы, подставки и коробочки для пробирок типа Эппендорф. Возможно комплектование диагностических центров любым оте­чественным и зарубежным оборудованием, программи­руемый термостат может снабжаться стабилизатором, а трансиллюминатор фотоаппаратом или монитором, компьютером для архивации результатов. ЗАО "ВСМ" обеспечит Ваших специалистов необходимыми методи­ческими материалами, проводит консультирование по лицензированию и интерпретации полученных резуль­татов. Одной из основных задач мы видим в пропаганде возможностей метода, внедрение его в сегодняшних не­простых условиях в медицинскую практику. В России и странах СНГ уже работают десятки лабораторий, по­ставленных ЗАО "ВСМ".

Суммируя преимущества использования тест-сис­тем на основе метода ПЦР, необходимо отметить:

1. Метод позволяет обнаруживать патогенные для человека бактерии и вирусы в тех случаях, когда други­ми способами это сделать невозможно.

2. Для диагностики практически всех известных в настоящее время заболеваний может быть использован один набор приборов и незначительно отличающиеся для разных инфекций наборы реактивов, что обуслов­лено химическим сродством нуклеиновых кислот. По­является возможность создания для многих биологиче­ских жидкостей и возбудителей создания универсальной процедуры приготовления пробы, выделения ДНК и постановки реакции.

3. Отпадает необходимость в средах, клеточных культурах, узкой специализации медицинского персо­нала. ПЦР-диагностикумы дают возможность избежать проблем, связанных с перекрестно реагирующими ан­тигенами.

4. Возможен анализ серонегативных пациентов на самых ранних стадиях инфекционного процесса, когда лечение наиболее эффективно.

5. Легко определяются патогенные возбудители, для которых не разработаны или затруднены методы куль­тивирования, а также для персистирующих форм пато­генных бактерий.

6. Метод позволяет поставить надежный диагноз в течение рабочего дня, т. е. за 6—8 ч.

7. Метод обладает высокой чувствительностью (до 1—5 копий возбудителя в пробе) и специфичностью (различают серологические штаммы).

8. Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы: обычно несколько микролитров.

9. Возможна одновременная диагностика несколь­ких возбудителей заболеваний в одной пробе.

10. Стоимость одного анализа при использовании отечественных приборов и реактивов сопоставима со стоимостью одного анализа иммуноферментным мето­дом.

В настоящее время ученые разных стран мира при­лагают усилия для дальнейшего развития метода ПЦР:

упрощения и автоматизации анализа, возможности синтеза больших фрагментов нуклеиновых кислот, рас­ширения приложений метода.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) имеет крайне высокую аналитическую чувствительность и позволяет идентифицировать патогенные микроорганизмы на любом филогенетическом уровне. Это обусловило его широкое применение в диагностике возбудителей инфекционных заболеваний с/х животных. В то же время высокая 'чувствительность метода при неправильном его использовании может привести к снижению специфичности ПЦР-анализа. Главной проблемой здесь является случайный перенос (контаминация) следовых количеств ДНК активной в ПЦР (специфических продуктов амплификации ДНК - «ампликонов», положительного контрольного образца, ДНК клинического образца, содержащего возбудитель) в реакционную пробирку, не содержащую возбудитель и как следствие появление ложноположительных результатов ПЦР.

Сотрудники практической ПЦР-лаборатории в своей работе сталкиваются с двумя основными видами контаминации:

1) перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложно-положительных результатов;

2) контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая наибольшее значение, поскольку в процессе ПЦР ампликоны накапливаются в огромных количествах и являются идеальными продуктами для реамплификации.

Необходимо также указать еще на две, часто встречающиеся, Причины контаминации. Одна из них связана с тем, что вблизи или даже в самом помещении, предназначенном для ПЦР, производится параллельная микробиологическая диагностика одноименных возбудителей инфекций или оба вида анализа выполняются одними и теми же сотрудниками. При этом контаминирущим материалом может стать ДНК, получаемых в больших количествах в процессе микробиологического наращивания возбудителей.

В научно-исследовательских учреждениях, занятых в разработке ПЦР-методик или организациях производящих ПЦР-тест-системы к вышеперечисленным источникам контаминации, может добавится контаминация рекомбинантными плазмидами, содержащими фрагменты генов мишеней для ПЦР, изготовляемых в качестве положительных контрольных образцов.

Среди всех вариантов контаминации наиболее часто встречающимся является контаминация «ампликонами» посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхностей лабораторных столов или поверхности кожи сотрудников лаборатории, что приводит к появлению систематических ложноположительных результатов.

Как правило, выявление; источника контаминации представляет, собой трудоемкую задачу, требующую- затрат времени и средств.

Накопленный к настоящему моменту опыт работы ведущих лабораторий ПЦР-дигностики инфекций позволяет сформулировать основные требования к планировке помещений и правила проведения самих анализов. Строгое соблюдение данных требований значительно снижает риск контаминации и получения ложноположительных результатов.

Планировка помещений и основные принципы организации работы ПЦР-диагностичвских лабораторий

1). Лаборатория должна быть разделена на зоны или комнаты для каждой из стадий ПЦР-диагностики. Следует иметь не менее двух комнат:

- ПЦР-помещение, где выделяются Зона 1 - для проведения обработки клинических образцов и Зона 2 - для приготовления реакционной ПЦР-смеси и внесения выделенных проб ДНК (при наличии условий Зону 1 и Зону 2 рекомендуется организовать в разных комнатах);

- в ПЦР-помещений запрещается проводить все другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, и т.д.), ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории.

- пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов амплификации;

- в пост-ПЦР-помещении допускается использовать другие методы детекции инфекций, диагностика которых проводится в данной лаборатории.

2). Комнату детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) следует располагать как можно дальше от ПЦР-помещений.

3). Следует исключить движение воздушного потока из пост-ПЦР в ПЦР-помещения.

4). Обработка клинических образцов должна производиться в ламинарном шкафу или настольном ПЦР-боксе, снабженном ультрафиолетовыми лампами.

5). Работа в лаборатории должна быть организована в одном направлении: ПЦР-помещений к пост-ПЦР-помещению.

6). Каждое помещение ПЦР-диагностической лаборатории должно иметь свой набор реагентов, автоматических пипеток, наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования, халатов и перчаток, используемых только в данном помещении и не выносящиеся в другие ПЦР-помещения. Оборудование, материалы и инвентарь в каждой комнате должны иметь соответствующую маркировку.

7). Следует однократно использовать перчатки как в комнате обработки клинических образцов, так и в комнате приготовления реакционной смеси и постановки ПЦР.

8). Необходимо однократно использовать пробирки и наконечники для автоматических пипеток. Обязательно менять наконечники при переходе от одной пробы к другой с целью предотвращения перекрестной контаминации в процессе выделения ДНК или при раскапывании реакционной смеси.

9). Целесообразно использовать наконечники для автоматических пипеток аэрозольным барьером (или наконечники с ватными фильтрами, приготовленными в помещении, в котором не ведутся работы с ДНК) при обработке клинических образцов, а также при внесении выделенной ДНК в реакционную пробирку.

10). Каждый сотрудник лаборатории должен иметь персональный набор автоматических пипеток и реагентов.

11). Клинические образцы должны храниться отдельно от реагентов.

12). Не следует использовать водяные бани, так как заполняющая их вода, просачиваясь в недостаточно плотно закрытые пробирки, может стать источников контаминации; следует использовать суховоздушные термостаты.

13). При исследовании материала зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний I-IV групп, работа должна проводиться с соблюдением "Санитарных правил СП 1.2.011-94 (Безопасность работы с микроорганизмами 1-II групп патогенности)" и "Положения о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения", М.,1980.

14). Необходимо постоянно поддерживать чистоту на рабочем месте:

- каждое помещение должно иметь свой отдельный набор инвентаря для обработки и уборки рабочего места (ватно-марлевые тампоны, пинцет, дезинфицирующий раствор и т.д.), и источники ультрафиолетового излучения, которые эффективно инактивируют ДНК-матрицы.

- при манипуляциях с клиническим материалом рабочую поверхность до и после исследования обрабатывают дезинфицирующим раствором (указанным для данного возбудителя).

- следует обрабатывать рабочую поверхность в комнате приготовления реакционной смеси до работы с целью борьбы с пылью.

15). Следует полностью исключить проведение в ПЦР-диагностической лаборатории работ, связанных с получением (клонированием) и выделением рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности ДНК или фрагментов генов возбудителей которые диагностируются данной лаборатории.

16). Персонал, работающий в ПЦР-диагностической лаборатории должен пройти соответствующее обучение.

Требования к проведению ПЦР-анализа

Обработка клинических образцов

1). Забор клинических образцов необходимо производить только одноразовые стерильные пластиковые пробирки или в стеклянные пробив предварительно обработанные в течение 1 часа хромовой смесью, тщател промытые дистиллированной водой и прокаленные.

2). Работать только в одноразовых перчатках.

3). Необходимо использовать одноразовые наконечники для автоматичес пипеток с аэрозольным барьером.

4). Обязательно менять наконечники при перехода от одной пробы к другой

5). Использованные пробирки и наконечники повторно не используются, должны сбрасываться в одноразовые контейнеры или в специальную емкость с раствором соляной кислоты.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 624 | Нарушение авторских прав