АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Краткие теоретические сведения. Куриные эмбрионы как живая система вошли в вирусоло­гическую практику в 30-х годах XX века

Куриные эмбрионы как живая система вошли в вирусоло­гическую практику в 30-х годах XX века. Их использование рас­ширило спектр культивируемых в лаборатории вирусов и позво­лило более успешно решать стоящие перед вирусологией задачи. Объясняется это тем, что РКЭ имеют ряд преимуществ перед дру­гими живыми системами:

1) это закрытая живая система. Скорлупа и подскорлупная оболочка надежно защищают эмбрион от бактериального зараже­ния;

2) у РКЭ высокая чувствительность к широкому спектру вирусов (недостаточное развитие защитных механизмов);

3) РКЭ — легкодоступный объект;

4) РКЭ — экономичная живая система, не требующая ухода и кормления;

5) РКЭ не образуют антител в ответ на заражение. Куриные эмбрионы используют в вирусологии для:

1) обнаружения в патматериале активного вируса или пер­вичного выделения вируса. Эффективно выделяют и культивиру­ют на куриных эмбрионах вирусы, вызывающие заболевания у птиц, а также некоторые вирусы млекопитающих;

2) поддержания вирусов в условиях лаборатории;

3) титрования вирусов;

4) накопления вируса для лабораторных исследований и по­лучения вакцин;

5) реакции нейтрализации, как тест-объект. При отборе куриных эмбрионов для заражения вируссодержащим материалом к ним предъявляют следующие требования: эмбрионы должны быть получены из хозяйств, благополучных по инфекционным заболеваниям, скорлупа яиц должна быть непиг­ментированной, чистой (мыть нельзя). Возраст эмбриона должен соответствовать избранному методу заражения.

Строение куриного эмбриона. Обычно курица откладывает оплодотворенное яйцо, в котором зародыш находится на стадии бластулы или ранней гаструлы. При нагревании яйца до темпера­туры, близкой к температуре тела курицы, происходит дальней­шее развитие зародыша. В период с 5-го по 12-й день инкубации куриные эмбрионы могут быть использованы для заражения ви­русами.

Куриное яйцо заключено в скорлупу, через ее поры совер­шается газообмен. Под ней лежит подскорлупная (белковая) оболочка. Это своеобразная буферная система между содержимым яйца и скорлупой. Подскорлупная оболочка в тупом конце яйца разделяется на два листка, между которыми образуется воздуш­ная камера (пуга).

Непосредственно под подскорлупной оболочкой находится хорион-аллонтоисная оболочка (ХАО — сосудистая оболочка), которая формирует аллонтоисную полость, заполненную жидкостью. На 11-12-й день развития количество ее достига­ет 6...7 мл. Тело зародыша лежит в яйце эксцентрично, спиной ближе к скорлупе, голова направлена в сторону воздушной камеры. Зародыш погружен в амниотическую жидкость, заполняющую амниотическую полость, сформированную из амниотической оболочки. Количество амниотической жидкости к 10-11-му дню развития эмбриона составляет в среднем 1 мл. Зародыш пуповиной связан с желтком, который располагается эксцентрично. Этот резервуар питательных веществ имеет наибольший объем в нача­ле инкубации, а по мере развития зародыша он уменьшается. Кроме того, в полости РКЭ находится белок, покрытый оболоч­кой, являющийся питательным материалом для эмбриона.

Размножение вирусов воз­можно во всех структурах эмбриона, имеющих клеточное строение, к которым относятся зародыш, ХАО и желточный мешок. Накопление вирусов происходит в тех же структурах, но целый ряд их может накапливаться в аллантоисной и в амниотической жидкостях, образуя практически готовую суспензию вирусов. Заражение в ту или другую область эм­бриона проводится в период ее максимального развития, когда количество чувствительных клеток будет наибольшим.

В процессе инкубации меняются размеры зародышевых структур, что во многом объясняется их функциональным назна­чением и определяет оптимальные для заражения возраст эм­бриона. Так, желточный мешок, как резервуар питательных ве­ществ, имеет наибольший объем в начале инкубации, а затем, после 12-го дня, по мере развития зародыша, он уменьшается. Заражают в желточный мешок с 5-го по 7-ой день инкубации.

Амниотическая полость, являясь буферной средой развития зародыша, покрывает его уже на 5-й день инкубации. Среднее количество жидкости к середине периода инкубации составляет около 1 мл. Для заражения в амниотическую полость используют эмбрионы в возрасте 6-10 дней.

Аллантоисная полость служит для сбора продуктов обмена, в ней скапливаются мочекислые соли, фосфорные и азотистые соединения. В процессе роста и развития зародыша аллантоисная жидкость приобретает кислую реакцию. Максимальных размеров аллантоисная полость достигает на 9-12-ый день развития эм­бриона, поэтому заражение в нее проводят преимущественно на 9-11-й день инкубации.

Хорион-аллантоисная оболочка богата кровеносными сосу­дами, которые, тесно прилегая к внутренней поверхности порис­той скорлупы, насыщаются кислородом и снабжают им тело за­родыша, выполняя функцию органа дыхания эмбриона. Максимального развития ХАО достигает на 11-13 день. Зараже­ние на хорион-аллантоисную оболочку проводят на 10-12 день инкубации.

Подготовка РКЭ для заражения. Эмбрионы доставляют из инкубатора, не допуская охлаждения в пути. В лаборатории их инкубируют в термостате при 37 °С и 60... 70% влажности. Для этого в термостат помещают открытые широкогорлые сосуды с водой. Эмбрионы ставят в специальные штативы воздушной ка­мерой вверх.

Поступившие в лабораторию РКЭ овоскопируют и отмечают простым карандашом границу воздушного пространства (пуги), тело и головку эмбриона, безсосудистую зону. Эти отметки служат ориентиром при выборе места введения вируссодержащего материала. При овоскопировании определяют жив зародыш или погиб. Зародыш, проявляющий активные движения при хорошей кровенаполненности сосудов ХАО, считается живым.

Заражение проводят в боксе. Рабочее место должно быть хорошо освещено. Перед началом работы стол дезинфицируют спиртом, поджигая его на столе.

Готовят следующие инструменты и принадлежности: комочки ваты для дезинфекции поверхности скорлупы, 0,5%-ную настойку йода, пробойники, шприцы, иглы, парафин в пипетках, подставки для эмбрионов. После этого рабочий стол в течение 1 ч облучают УФ-лучами.

Способы, заражения. Существует ряд способов заражения эмбрионов. При любом из них скорлупу яйца над местом введения материала обрабатывают спиртом, обжигают, затем об­рабатывают слабым раствором йода и вновь обжигают.

Одним из распространенных в вирусологии способов явля­ется заражение на хорион-аллантоисную оболочку. Оно применя­ется в тех случаях, когда, вирус хорошо размножается в клетках этой оболочки (поксвирусы — вирусы оспы, осповакцины, эктромелии; герпесвирусы — вирус ларинготрахеита; онкорнавирусы — вирус лейкоза кур и др.) Для этой цели ис­пользуют 11-14-дневные РКЭ.

Техника заражения сводится к следующему. В центре воз­душной камеры снимается часть скорлупы и в результате обна­жается подскорлупная оболочка. Ее приподнимают и удаляют — обнажается прозрачная, блестящая, красная, пронизанная крове­носными ссудами хорион-аллантоисная оболочка. На нее пипет­кой наносят вируссодержащий материал в дозе 0,1-0,2 мл. После этого окошечко в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом, стеклянным колпачком или лейкопластырем, края заливают стерильным парафином.

Заражение в аллантоисную полость наиболее часто приме­няют при культивировании тех вирусов, которые размножаются в клетках эпителия (орто- и парамиксовирусы, онкорнавирусы, герпесвирусы и др.). Вирус при этом поступает в аллантоисную жидкость, накапливаясь в ней в высоких концентрациях (вирус гриппа). Возраст куриных эмбрионов должен быть 10-11 суток.

Вируссодержащий материал можно вводить двумя способа­ми.

1. Делают прокол в скорлупе над центром воздушной каме­ры. Через отверстие шприцем с короткой иглой, который держат в вертикальном положении, вводят материал (0,1...0,2 иногда 0,5 мл) на 2-3 мм ниже границы воздушной камеры. Затем отвер­стие в скорлупе заливают стерильным парафином или закрывают лейкопластырем.

2. Делают два прокола — первый в скорлупе над воздушной камерой, второй — над безсосудистой зоной. Через второе отвер­стие с помощью шприца вводят материал (0,1...0,2 мл) прямо в аллантоисную полость. Для того, чтобы жидкость не выливалась обратно, через первое отверстие пипеткой с резиновой грушей от­сасывают воздух, затем оба отверстия заливают парафином.

Заражение в амниотическую полость — самый эффектив­ных метод выделения ряда орто- и парамиксовирусов. При этом способе вирус размножается в органах и тканях эмбриона. Для заражения обычно используют 6...11-дневные эмбрионы. Следует отбирать такие эмбрионы, у которых зародыши близко располо­жены к воздушному пространству.

Существует два способа введения материала в амнион.

1. Скорлупу над воздушной камерой удаляют и в образо­вавшемся окне глазным пинцетом осторожно отслаивают 1...1,5 см подскорлупной оболочки. Через обнажившийся участок хорион-аллантоисной оболочки тем же пинцетом делают прокол в направлении к эмбриону в том месте, где нет сосудов. Далее за­хватывают амниотическую оболочку и осторожно извлекают часть ее наружу через образовавшееся отверстие в хорион-аллантоисной оболочке. В складку амниотической оболочки с по­мощью шприца вводят вируссодержащий материал в дозе 0,05...0,2 мл. Отверстие в скорлупе закрывают стеклянным кол­пачком или лейкопластырем, края заливают стерильным пара­фином. Это так называемый открытый способ (метод окна).

2. В центре воздушной камеры производят прокол скорлу­пы. Через образовавшееся отверстие иглу шприца вводят на 8...1,2 см ниже границы воздушной камеры. Под легким давле­нием игла проникает в амниотическую полость, куда и вводят 0,1...0,2 мл материала. После заражения отверстие в скорлупе яаливают стерильным парафином. Это закрытый способ заражения в амниотическую полость.

Заражение в желточный мешок используют для культиви­рования поксвирусов - вирусов группы оспы, орта- и парамиксо-вирусов (вирусы гриппа, болезни Ньюкасла, возбудитель орнитоза и др.). Для заражения в желточный мешок пригодны 5…6-дневные эмбрионы. В скорлупе над воздушной камерой делают прокол, накло­няют яйцо в направлении местонахождения эмбриона и вводят длинную иглу шприца на глубину 2,5...4,5 см от поверхности скорлупы, наклоняя ее в сторону, противоположную эмбриону. Доза вируссодержащего материала 0,2...0,5 мл. Методы зараже­ния РКЭ при диагностике ряда вирусных инфекций представлены в табл.2.

Таблица 2.

Использование РКЭ для культивирования вирусов

Заражение эмбрионов всегда сопровождают следующие контроли: а) на спонтанную возможность заражения. В термостат ставят несколько эмбрионов, с которыми не проводили никаких манипуляций; б) на токсичность материала. РКЭ заражают фильтратом исследуемого патологического материала после уничтожения в нем вирусов автоклавированием; в) контроль жидкости, в которой разводили вируссодержащий материал (раствор Хенкса, физиологический раствор и пр.).

Для исследования вируссодержащего материала и контро­лей используют не менее 4-х эмбрионов (чаще 5-7).

Инфицированные и контрольные эмбрионы помещают в термостат или инкубатор для дальнейшей инкубации при 35...37 °С и относительной влажности 60...70%. Эмбрионы еже­дневно овоскопируют, погибших помещают в холодильник (4-6 °С) на 2...3 ч, а затем вскрывают.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 664 | Нарушение авторских прав