АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. В настоящее время в лабораторной диагностике КЧС используются три метода обнару­жения специфических AT к ВКЧС: реакция нейтрализации флюоресцирующих

Прочитайте:
  1. E. АИВ инфекциясына серодиагностика
  2. II. Диагностика
  3. II. Диагностика
  4. II. Диагностика
  5. II. Диагностика
  6. III. Диагностика лекарственной аллергии
  7. III. Лабораторная диагностика хронического панкреатита
  8. IV) Травматические повреждения периферический нервов и сплетений. Клиника, диагностика, лечение, виды операций.
  9. IV. Диагностика
  10. IV. Дифференциальная диагностика

В настоящее время в лабораторной диагностике КЧС используются три метода обнару­жения специфических AT к ВКЧС: реакция нейтрализации флюоресцирующих микробля­шек (РНФБ), реакция непрямой ИФ и непрямой вариант твердофазного ИФА. Наиболее эффективными методами обнаружения специфических AT к ВКЧС являются РНФБ и ИФА. Эффективность обнаружения AT к ВКЧС в ИФА по сравнению с РНФБ составляла 96,5%. На основании этих данных непрямой вариант ИФА рекомендован для обнаружения специ­фических AT к ВКЧ.

НИФ. НИФ применяется для выявления и титрования AT в сыворотках крови перебо­левших свиней. Используют зараженные вирусом перевиваемые клетки (РК-15) на стек­лышках, на которых титруют испытуемые сыворотки в 2-кратных разведениях от 1:20 до 1:640 в непрямой ИФ по общепринятой методике с использованием во втором этапе реак­ции антисвиного ФИТЦ-Ig. Титром AT к КЧС считают последнее разведение сыворотки, обеспечивающее зеленое свечение (на 2 креста) диффузного цитоплазматического АГ виру­са при отсутствии подобного свечения в контролях с интактными тест-объектами и нор­мальной свиной сывороткой.

Реакция нейтрализации флюоресцирующих бляшек (РНФБ). В качестве чувстви­тельной системы необходимо использовать перевиваемую культуру клеток РК-15, выращен­ную на покровных стеклах в пробирках. РНФБ проводят микрометодом, используя пласти­ковые панели Titertek. Суспензию клеток (в 1 мл 10-800 тыс. клеток) готовят на среде Игла (MEM) с 5% фетальной сыворотки крови КРС с добавлением буфера HEPES. Постановка микрометодом РНФБ более производительна, чем использование макрометода (28). Данный метод может успешно применяться и для титрования специфических AT. Пробы сывороток крови берут от животных не ранее 15 дн. после клинического выздоровления. Пе­ред использованием их инактивируют при 56°С 30 мин. Сыворотки разводят от 1:2 до 1:2560 и смешивают с равным объемом вакцинного вируса в количестве 100 ККИД5о (клеточно-культуральных инфекционных доз), встряхивают и выдерживают 60 мин при 37°С. Каждое разведение сыворотки с вирусом вносят по 0,4 мл в 4 пробирки с культурой клеток РК-15 на стеклышках. Адсорбируют 2 ч при 37°С. Смесь сыворотка-вирус сливают, отмывают клетки средой, заливают 2 мл поддерживающей среды и инкубируют при 37°С. Реакцию учитывают через 48 ч инкубации. Препараты вынимают из пробирок, ополаскивают в 0,01 М ФБР рН 7,2-7,4 и обрабатывают, как указано выше. Реакция сопровождается соответствующими контролями (смесь вируса со средой, гипериммунной и нормальной сыворотками и незараженная культура клеток). От­сутствие флюоресцирующих микробляшек (при наличии их в контроле вируса в смеси с пи­тательной средой и нормальной сывороткой) в препаратах ВКЧС, обработанных гиперим­мунной и испытуемыми сыворотками в разведении 1:2 и выше, указывает на наличие в ма­териалах специфических AT. Титром AT считают то предельное разведение сыворотки, при котором наблюдается полное подавление образования флюоресцирующих микробляшек.

Во избежание получения ложных результатов при использовании культуры клеток необ­ходимо добавлять в среду бычью сыворотку, свободную от вируса диареи КРС и AT. BHA выявляются через 21 день после заражения. Обнаружение их с помощью непрямой ИФ в культуре клеток широко применяли в США на последних этапах программы искоренения болезни. Однако при интерпретации результатов следует учитывать частые случаи инаппарантной инфекции у свиней, вызванной серологически родственным вирусом диареи КРС, поэтому все положительно реагирующие сыворотки свиней необходимо исследовать и на вирус диареи.

Для массового обследования свиней на субклиническую инфекцию КЧС в ФРГ пред­ложен тест, сочетающий РН с ИФ. В качестве тест-системы используют культуру клеток РК-15. Если у одной или нескольких свиноматок отдельного стада в сыворотке крови обна­руживают BHA, всех поросят убивают с последующим исследованием органов ИФ.

При исследовании проб сывороток из неблагополучных хозяйств в РН (с 200-300 БОЕ патогенного шт. Альфорт 331) до 50% их оказалось положительными. Наличие AT свиде­тельствовало о носительстве вируса. Вирус смогли выделить только у молодых поросят.

Описана усовершенствованная методика выявления BHA к ВКЧС, в которой постановка теста значительно облегчена за счет использования цитолитического штамма вируса, выде­ленного из персистентно инфицированной перевиваемой культуры клеток JB-RS-2 и инду­цировавшего четкое ЦПД в нескольких перевиваемых линиях клеток почки поросенка. Ре­акцию ставят в культуре клеток РК-15 на микропанелях при 38°С в термостатах с подачей СО2. По воспроизводимости и чувствительности методика не уступает реакции с ис­пользованием метода ИФ AT, но требует значительно меньшего труда. Предлагаемый метод обладает рядом преимуществ: исключает необходимость использования ИФ; учет результа­тов можно проводить без микроскопа; реакцию ставят микрометодом; используемый вирус аттенуирован. Для постановки РН необходимо вначале провести титрование ВКЧС.

ИЭОФ. Используется в 1%-ной агарозе как диагностический при выявлении AT к ВКЧС в сыворотках зараженных свиней. Для исследования применяется АГ, экстрагиро­ванный из зараженных ВКЧС клеток РК-15. Показано, что этот культуральный АГ ВКЧС идентичен преципитирующему АГ вируса, экстрагированного из ткани селезенки заражен­ных свиней. Обнаружено, что ПА к ВКЧС появляются в сыворотках через 2-3 нед. после за­ражения животных слабовирулентными штаммами или модифицированным живым вак­цинным штаммом. Выявлено, что метод ИЭОФ в 2-16 раз чувствительнее, чем иммунодиффузия в агаровом геле. Несмотря на меньшую его чувствительность по сравнению с РН, ре­зультаты, полученные с помощью ИЭОФ, хорошо согласуются с результатами, полученны­ми методом подавления бляшкообразования. Считается, что ПА к ВКЧС могут персистировать до 3 лет после 1-кратной вакцинации шт. С. Методом ИЭОФ невозможно было диф­ференцировать AT к ВКЧС от AT к вирусу диареи КРС; при получении положительных ре­зультатов необходимо сочетать его с РН.

ИФА в непрямой модификации. На миллипоровские фильтры (тип ОН, диаметр пор 0,3 мм), диаметр которых равен 0,6 см, смоченные р-ром АГ ВКЧС, наносят свиные сыво­ротки. Затем фильтры инкубируют в р-ре кроличьего IgG (против IgG свиньи), меченого пероксидазой хрена RZ=3,0. Активность связанной пероксидазы определяют в р-ре субстрата 3,3-диаминобензидина. Опытные образцы окрашивались в коричневый цвет, контрольные оставались бесцветными. Реакция громоздкая.

ELISA. Разработан метод определения AT к ВКЧС на микроплатах, поддающийся ав­томатическому анализу. Описана методика получения очищенного и концентрирован­ного АГ для теста ELISA из шт. Альфорт, размноженного в культуре клеток РК-15. Резуль­таты ELISA и РН близки. ELISA легок в выполнении, дешев, позволяет быстро иссле­довать большое количество образцов, высокочувствителен и рекомендован в качестве мето­да оценки при крупномасштабных обследованиях.

С использованием иммуноглобулинов баранов, инфицированных ВКЧС, разработана технология изготовления ИФ-конъюгатов, пригодных для выявления вирусного АГ в пато­логическом материале. При постмортальной диагностике вирус выявляется со 100% эффек­тивностью без биологического накопления. При экспериментальном заражении вирус в про­бах мочи и крови обнаруживали через 8-10 ч, при контактном заражении - через 72-96 ч. Положительные результаты при индикации ВКЧС в объектах ветеринарного надзора (зерно, почва, вода) получены при концентрации вируса, превышающей 100 ИД. Пока­зано успешное применение ИФА для выявления ВКЧС в культуре клеток РК-15.

Описано получение монАТ для диагностики КЧС на мышах линии BALB/c 4-кратно иммунизированных ВКЧС (шт.Альфорт). Клетки селезенки мышей "сливали" с миеломными клетками Sp2/0. Полученные гибридомы культивировали в 20% среде ДМЕМ Ну-Нт при 37°С в атмосфере 5% С02. Продуцирующую специфические AT культуру дважды субклонировали и после определения изотипа AT инокулировали интраперитонеально мышам BALB/c. Образующаяся асцитная жидкость содержала высокие концентрации монАТ, кото­рые после соответствующей очистки конъюгировали пероксидазой хрена.

Разработан способ изготовления иммуноферментных коньюгатов для ИФА с использо­ванием монАТ к ВКЧС с сохранением активности фермента и высокой специфической активностью иммуноглобулина, а также метод флюоресцирующих зондов (МФЗ), ко­торый не уступал по чувствительности и специфичности МФА. Разработан метод выявления ВКЧС методом молекулярной гибридизации и ПЦР.


Дата добавления: 2014-12-11 | Просмотры: 662 | Нарушение авторских прав



1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 |



При использовании материала ссылка на сайт medlec.org обязательна! (0.003 сек.)