АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

ДИАГНОСТИКА

Предположительный диагноз на АЧС может быть поставлен на основании анализа клинико-эпизоотологических данных и патологоанатомических исследований Основанием для подозрения АЧС может служить возникновение заболеваний с быстрым течением и высокой смертностью среди свинопоголовья, привитого против классической чумы свиней Сходство клинических и патологоанатомических признаков классической и африканской чумы свиней затрудняет постановку диагноза

В отличии от возбудителя классической чумы вирус АЧС имеет многообразие в анти­генном и иммунологическом отношениях, ГАд и негемадсорбирующие штаммы, что значи­тельно усложняет постановку диагноза Возбудители АЧС и КЧС вариабельны и по виру­лентности в природе выделены штаммы вируса, вызывающие различные формы и течения болезни - сверхострое, острое, подострое, хроническое бессимптомное с летальностью от IО до 100%, встречаются и природноослабленные, авирулентные штаммы Поэтому дифферен­цировать АЧС на основании клинико-эпизоотологических данных и патоморфологических изменений чрезвычайно трудно, необходимо прибегать к лабораторному анализу.

Методы лабораторной диагностики Их можно разделить на 2 группы, первая вклю­чает методы выделения вируса и выявления АГ, вторая - методы выявления AT.

Экспресс-метод обнаружения вируса. Во Франции разработан метод определения ви­руса АЧС в культурах клеток и полевых пробах с помощью ДНК-зонда, меченного биотином Данный метод позволяет обнаружить негемадсорбирующие штаммы вируса АЧС, не­большие количества его в материалах и убитые или поврежденные вирионы Полученный зонд в 10 раз чувствительнее ³²Р-меченого зонда. В процессе усовершенствования метода гибридизационного зонда, предложен не менее быстрый и биологически безопасный метод диагностики АЧС с помощью ПЦР с фрагмен­том длиной 740 тыс п о, полученным из консервативной части генома вируса Идентифи­кация амплифицированного фрагмента проводится с помощью гнездных праймеров или при использовании биотинилированных олигонуклеотидных зондов Метод превосходит выде­ление вируса и Гад. В нашей стране применена ПЦР для обнаружения последователь­ностей ДНК, специфичных для вируса АЧС Показана возможность амплификации индиви­дуальных фрагментов ДНК вируса АЧС различных серотипов, а также повышение чувстви­тельности индикации с использованием ПЦР и гибридизацией про­дуктов ПЦР с нерадиоактивным ДНК-зондом.

Индикация и идентификация вируса. При первичном возникновении АЧС лабора­торная диагностика основана на выделении вируса в культуре клеток костного мозга или лейкоцитов крови свиней, его идентификации в реакции ГАд или прямой ИФ и определения типовой принадлежности вируса в РЗГАд Для выявления вируса АЧС непосредственно в жидкой пробе предложено использовать сенсибилизированные эритроциты, иммуносорбент сефарозу и суспензию клеток костного мозга для специфического концентрирования АГ ви­руса АЧС из объектов ветнадзора с последующим его определением 125g AT

Выделение и индикация вируса в культурах клеток. Наиболее достоверным и на­дежным лабораторным методом диагностики АЧС - выделение вируса в клеточных культу­рах и идентификации его в РГАд Биопроба длительна по времени и проводится в учрежде­ниях, где имеются для этого ветеринарно-санитарные условия для работы с особо опасными экзотическими болезнями. Наиболее достоверный и надежный лабораторный метод - РГАд Она состоит в том, что зараженные вирусом АЧС мононуклеарные фагоциты в ККМС (культура клеток мозга свиней) или КЛС (культура лейкоцитов свиней) приобретают спо­собность адсорбировать на себя эритроциты крови свиньи, образуя при этом скопления в виде ягоды малины Для получения ККМС и КЛС используют клинически здоровых под­свинков 2-4-мес возраста массой 25-30 кг из хозяйств, благополучных по инфекционным болезням. Лейкоциты получают из гепаринизированной крови подсвинков. О размножении вируса судят по РГАд Для заражения используют 2-3-сут культуру лей­коцитов или клеток костного мозга свиней Вирус АЧС характеризуется рядом уникальных особенностей Во-первых, популяция его гетерогенна, во-вторых, некоторые штаммы вируса способны вызывать атипичную "рыхлую" ГАд, в отличие от типичной "многослойной" Гад. Некоторые варианты АЧС не обладают ГАд свойствами, а вызывают только ЦПД, проявляемое лизисом зараженных клеток При выделении негемадсорбирующих изолятов идентификацию проводят в ИФ или ставят биопробы.

Тест ауто-ГАд. Метод постановки ауто-ГАд основывается на выявлении ГАд клеток, образовавшихся в крови больного животного. Данный способ по чувствительности сравним с описанной выше РГАд в ККМС или КЛС Однако его применение позволяет получить предварительный результат в течение 1-3 ч после отбора пробы крови без убоя животного Реакция считается положительной, если в культуре клеток, зараженной одним из материа­лов, обнаружена четкая ГАд, при отсутствии ее в контроле Результат - от­рицательный при отсутствии ГАд и ЦПД в культурах клеток в течение 3-х пассажей

РЗГАд. Предназначена для определения типовой принадлежности ГАд штаммов вируса АЧС и основана на способности специфических сывороток одерживать ГАд в культурах клеток КМС и ЛС, зараженных гомологичным типом вируса АЧС РЗГАд ставят со стан­дартными специфическими сыворотками серотипов 1, 2, 3 и 4, полученными, на соответст­вующие эталонные штаммы вируса АЧС ("Лиссабон-57" -1-й тип, "Конго-73" - 2-ой тип, "Мозамбик-78" - 3-й тип, "Португалия-60" - 4-й тип). Материал эталонных штаммов и ти-пируемых изолятов используют с активностью 10⁴-10⁶ ГАЕ₅о/мл, а типоспецифические сы­воротки - не менее 1 50. Зараженные и контрольные культуры клеток инкубируют при 37-38°С Учет реакции ежедневный в течение 2 сут при отсутствии неспе­цифической дегенерации в контроле культур клеток и сывороток, наличии ГАд в контроле,

РДП. Успешно применяется для обнаружения специфического АГ в органах павших свиней (печень, селезенка), а также для выявления специфических ПА в сыворотках и тка­нях хронически больных животных. РДП - относительно низкочувствительная Она прояв­ляется с тканями, полученными через 24 ч и после подъема температуры, перед появлением других симптомов болезни. Поскольку специфичность РДП была доказана и при европей­ской чуме свиней, ее предложили для дифференциации двух видов чумы свиней. Для этого используют сыворотку свиней, иммунизированных аттенуированным вариантом вируса, ко­торая дает преципитацию с материалами от свиней и с детритом инфицированных клеток. По отдельным отзывам, РДП при АЧС специфична и удобна в полевых условиях при остром течении болезни В Испании сравнивали РДП с другими методами Установили, что РДП удобна, но ее чувствительность ниже, чем других Поэтому реакцию рекомендуют для предварительной диагностики Чувствительность РДП при выявлении вирусного АГ 50%. Реакцию считают положительной, если между лунками со специфическим и испытуе­мым компонентами (АГ и сыворотками) через 12-24 ч появляются одна или две линии пре­ципитации Они должны быть тонкими и иметь четкие границы. При отсутствии их - реакцию считают отрицательной

ИФ. Применяют для выявления специфического АГ АЧС в мазках-отпечатках, приго­товленных из проб органов больных или павших свиней, а также в культуре клеток, инфи­цированных вируссодержащим материалом.

Испытуемые материалы пробы органов и тканей от больных и павших свиней, куль­тура ЛС или КМС, инфицированная испытуемым материалом, флюоресцирующие Ig спе­цифические по ТУ 4620-81 Контрольные материалы пробы органов и тканей интактных свиней, интактная культура ЛС или КМС При сомнительных результатах дальнейшие ис­следования с помощью ИФ проводят в культуре ЛС и КМС, инокулированной подозревае­мым в заражении вирусом АЧС материалом, через 24-72 ч после его внесения

Модифицированный прямой метод РСК чувствителен при обнаружении антигена вируса АЧС в испытуемых тканях, взятых от свиней в период острой болезни (через день после по­вышения температуры) При помощи модифицированной РСК устанавливают лишь сыворо­точные AT (в случаях серологической оценки постинфекционного и поствакцинального им­мунитетов) КС АГ получают методом экстракции ткани смесью ацетона и эфира

Биопроба. Ставят с разрешения Департамента ветеринарии При первичном подозре­нии на АЧС ее постановка обязательна Биопробу ставят по одному из двух вариантов

Первым еариант Четырех из восьми подсвинков 2-4-мес возраста, иммунных к класси­ческой чуме, заражают внутримышечно вирусом КЧС, а 4-х - испытуемым материалом (кровь, суспензия органов) У всех подопытных животных ежедневно измеряют температу­ру Если зараженные животные заболеют и погибнут (обычно в течение 10 дн), а все инфи­цированные вирусом КЧС останутся здоровыми, в испытуемом материале содержится вирус АЧС Специфичность гибели зараженных животных должна быть подтверждена характер­ными для АЧС клиническими симптомами и патологоанатомическими изменениями, а так­же выделением от павших животных вируса и его идентификацией Если после заражения останутся здоровыми все 8 подсвинков испытуемый материал содержит вирус КЧС. Второй вариант Восемь подсвинков 2-4-мес возраста массой от 25 до 40 кг (4 из них должны быть иммунны к КЧС, а 4 - не иммунны) заражают внутримышечно суспензией из испытуемого материала (или кровью) Если иммунизированные против КЧС животные ос­танутся здоровыми, а не иммунизированные погибнут, значит, в испытуемом материале был вирус КЧС Если же погибнут все 8 подсвинков - в испытуемом материале был вирус АЧС В последнем случае специфичность гибели подсвинков от АЧС должна быть подтверждена, как указано выше В случае опасности появления АЧС на территории страны диагноз на КЧС и АЧС ставят одновременно Поэтому второй вариант иммунологической пробы пред­почтительнее, так как позволяет диагностировать обе болезни одновременно Биопроба ме­тодологически не сложна, но в санитарном отношении должна быть проведена с соблюдени­ем мер, абсолютно исключающих вынос инфекции

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Определение AT к вирусу АЧС имеет большое эпизоотологическое значение ввиду длительной персистенции вируса в орга­низме свиней без проявления клинических признаков болезни Такие животные - вирусоносители могут явиться источником инфекции. По индикации AT можно судить о ко­личестве хронических и субклинических случаев болезни.

НИФ. Она может с успехом применяться в лабораторной диагностике для определения специфических AT к вирусу АЧС. Данный метод оказался ценным при установлении эпизо­отической ситуации. С его помощью установлены AT у больных свиней-хроников в 100% и у свиней-вирусоносителей в 74,5% случаев. В качестве АГ для непрямого метода ИФ ис­пользуют 4-5-дн КЛС, зараженные вирусом АЧС. Через 24-48 ч после заражения культуры фиксируют в ацетоне, после чего наслаивают на 60 мин исследуемые сыворотки и еще на 30 мин антисвиную коньюгированную сыворотку. При положительной реакции в цитоплазме наблюдают ярко-зеленое свечение вирусных включений. Для контроля используют зара­женные клеточные культуры, обработанные сывороткой здоровых свиней.

В 1976 г. был разработан новый метод, основанный на выявлении специфических AT в экстрактах тканей погибших животных. Эти AT в НИФ были идентифицированы как IgG. AT служила культура клеток, выращенная на покровных стеклах и зараженная адаптиро­ванным вирусом. Анти-АЧС-IgG обнаруживали в различных тканях (легких, селезенке, лимфоузлах, печени, почках, поджелудочной железе, мозге и коже) через 12-14 дн после инокуляции. Лучшие результаты получали с пробами селезенки и легких: в зависимости от клинической стадии титры AT колебались в пределах от 1.5 до 1.5000. Исследование ткане­вых AT погибших свиней - более чувствительный метод, чем обнаружение вирусного АГ. Метод прост, исследование выполняется за 2-3 ч. По данным испанских ученых у свиней, при хроническом течении болезни AT выявляют в 100%, у свиней-вирусоносителей - в 74,5% случаев. Положительный результат указывает на АЧС, и дальнейших исследований не проводят Метод непрямой ИФ используют при хроническом и латентном течении АЧС для выявления AT в сыворотках крови, суспензий из органов

Испытуемые материалы, суспензии из проб органов (20%) от павших, вынужденно убитых или подозреваемых в заражении АЧС и вакцинированных животных; сыворотки крови хронически больных, переболевших и вакцинированных животных.

ИФА. ИФА (ELISA) используют для обнаружения специфических AT в сыворотках крови больных АЧС. Набор препаратов для непрямого метода ИФА вклю­чает, антивидовой (антисвиной) пероксидазный конъюгат (антисвиные Ig сыворотки осла, меченые пероксидазой); специфическая сыворотка свиньи, содержащая AT к вирусу АЧС, контрольная (нормальная) сыворотка свиньи; специфический культуральный АГ для серо­логической диагностики АЧС; контрольный АГ из незараженной культуры клеток. Поли­стироловые пластины для ИФА сенсибилизируют специфическим и нормальным АГ, взя­тыми в рабочих разведениях, в течение ночи при комнатной температуре во влажной камере в 0,5 М карбонатно-бикарбонатном буферном р-ре. Учет результатов проводят через 20 мин после проявления окраски на сканирующем спектрофотометре при длине волн 492 нм или визуально. Для визуального учета необходимо остановить реакцию, внося в лунки по 25 мкл 2,5 М H₂SO₄ Реакцию учитывают по разности поглощения сыворотки в испытуемых разве­дениях против специфического и контрольного АГ Результат считают положительным, если разница поглощения при разведении сыворотки 1:125 превышает 0,1

Метод ингибирования твердофазного ИФА. Предназначен для выявления специфи­ческих к вирусу АЧС антител в сыворотке крови или суспензиях проб органов животных с низким их уровнем (1:5-1.25) в ранние сроки после вакцинации или заражения (3-5 сут). Преимущество его заключается в том, что он позволяет выявлять AT в цельной пробе и проще в техническом исполнении, не уступая по чувствительности непрямому методу

Инструментальный учет проводят после внесения субстрата и инкубирования пластин в темноте при комнатной температуре аналогично непрямому ИФА Если интенсивность (оптическая плотность) окрашивания в лунках с испытуемыми пробами снижается на 50% и более по отношению к оптической плотности содержимого лунок с нормальной сывороткой, т е оптическая плотность содержимого лунок с исследуемой сывороткой в 2 раза и более ниже, то данная сыворотка считается положительной

ВИЭОФ. Используют для выявления специфических AT в сыворотках крови больных свиней при хроническом и латентном течении АЧС. В РФ предложен порядок и схема лабораторных исследований при первичном диагностировании АЧС. Патматериал из первичного эпизоотического очага направляют во ВНИИВВиМ Предварительно диагноз ставят на основании экспресс-анализа поступившего материала при выявлении специфиче­ского АГ и AT в прямой ИФ и непрямой ИФ с ответом через 3 ч с момента получения проб Диагноз подтверждают выделением возбудителя в КЛС или КМС и биопробой на подсвин­ках Затем вирус идентифицируют и типируют в РГА, ИФ и РЗГА, при положительных ре­зультатах ставят окончательный диагноз АЧС исключают на основании отрицательных данных выявления АГ и AT в ИФ, твердофазного ИФА и ВИЭОФ, выделения и идентифи­кации вируса в культуре клеток в течение трех последовательных пассажей (15 сут) проб патматериала и сыворотки крови животных, подозреваемых в заражении. Патологический материал из вторичных эпизоотических очагов АЧС исследуют в зо­нальных специализированных лабораториях по особо опасным заразным болезням живот­ных и во ВНИИВВиМ Зональные специализированные лаборатории при наличии специфи­ческих АГ или AT в исходных пробах через 2-3 ч ставят предварительный диагноз на АЧС и направляют материал во ВНИИВВиМ Ретроспективную диагностику проводят выявлени­ем антител в сыворотке крови свиней ВИЭОФ и твердофазным ИФА Отсутствие их дает основание дать отрицательный результат на АЧС Положительные данные ВИЭОФ или твердофазного ИФА подтверждает непрямой ИФ, после чего ставится диагноз на АЧС Во ВНИИВВиМ на основании выделения, идентификации и типирования возбудителя в культу­рах КЛС или ККМС в РГА, ИФ и РЗХГА через 1-15 сут устанавливают окончательный ди­агноз на АЧС, вызванную ГАд штаммами Низковирулентный негемадсорбирующий вирус АЧС (летальность 30-50%) выявляют обнаружением специфических AT в ИФ, выделением возбудителя в течение 1-3 пассажей (5-15 сут) в клетках КЛС и КМС и идентификацией АГ в ИФ При необходимости проводят биопробу Отрицательное заключение на АЧС во вто­ричных эпизоотических очагах дают по тем же критериям, что и в первичном

Современная дифференциальная диагностика АЧС и КЧС обеспечивает проведение со­ответствующих противоэпизоотических мероприятий по локализации, ликвидации и преду­преждению распространения в наиболее сжатые сроки Разработка наборов препаратов для выявления АЧС и КЧС, оценка их эффективности на большом полевом материале позволи­ли предложить схему лабораторной дифференциальной диагностики этих болезней ИФ мазков-отпечатков, несмотря на низкую чувствительность широко применяют в зональных специализированных лабораториях при предварительной оценке материала для последую­щего направления в региональный центр Исследуемым материалом для выделения вирусов АЧС и КЧС сразу же инокулируют культуры ККМС (КЛС) и РК-15 В течение 1-5 сут инку-бирования культуры клеток 1-го пассажа контролируют РГА и ИФ на наличие вируса АЧС, исключая возможную неспецифическую ГАд или наличие негемадсорбирующего вируса Для обнаружения вируса КЧС в культуре клеток РК-15 ИФ проводят ежедневно в течение 4 сут При отрицательных результатах делают 3 пассажа с обязательной ИФ

В случае выделения вируса АЧС его типируют в РЗГА Одновременно пробы исследуют на наличие специфических AT в сыворотке и органах (20%-ная суспензия) унифицирован­ной ИФ на оба вируса, методом ингибирования твердофазного ИФА возбудителя АЧС и РН флюоресцирующих микробляшек (РНФБ) вируса КЧС Положительные результаты ИФ и РНФБ на КЧС оценивают в зависимости от сроков проведения вакцинации, а на АЧС - да­ют основание поставить окончательный диагноз

Дата добавления: 2014-12-11 | Просмотры: 1129 | Нарушение авторских прав