АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Шаг 1: 3-7 дней до начала работы

1. Приготовьте питательный агар

Чашки с агаризованной средой нужно залить как минимум за три дня до предполагаемого времени использования. Им нужно дать постоять два дня на столе при комнатной температуре, а потом убрать в холодильник. За два дня агар подсыхает и лучше впитывает трансформационный буфер.

Чтобы приготовить 500 мл LB-агара, добавьте 500 мл воды к содержимому пакета с сухим LB-агаром в литровой или двухлитровой колбе Эрленмейера. Перемешайте вручную, или воспользуйтесь магнитной мешалкой. Доведите агар до кипения в микроволновке. Выньте и аккуратно перемешайте. Повторите процедуру как минимум 3 раза, уменьшив мощность печи до минимума, пока агар полностью не растворится (то есть пока вы не перестанете видеть плавающие в жидкости частицы). Обязательно наденьте рукавицы и дайте колбе чуть-чуть остыть перед перемешиванием, чтобы горячая среда не выплеснулась вам на руки. Когда агар полностью растворится, дайте колбе остыть до температуры, когда вы сможете держать ее в руках, не боясь обжечься (50°С). Удобно использовать на этом этапе термостат или водяную баню, поставленную на 50°С. Пока агар остывает, приготовьте и подпишите чашки, и приготовьте растворы арабинозы и ампициллина (см. ниже). Но будьте внимательны, чтобы агар не остыл слишком сильно и не начал застывать.

1. Приготовьте арабинозу и ампициллин

Внимание: арабинозе нужно как минимум 10 мин, на то, чтобы раствориться -будьте терпеливы

Ампициллин и арабиноза поставляются сухими в маленьких флакончиках. После растворения в воде они добавляются в жидкую питательную среду. Ампициллин это антибиотик, ингибирующий рост контаминирующих бактерий, которые могут быть занесены в культуру из окружающей среды. Арабиноза это сахар, индуцирующий производство зеленого флуоресцентного белка в клонированных клетках.

Используя стерильную пипетку, добавьте 3 мл трансформационного раствора прямо во флакон с ампициллином. Используя другую пипетку, добавьте 3 мл трансформационного раствора во флакон с арабинозой. Перемешайте и аккуратно встряхните флаконы, чтобы ускорить процесс.

(трансформационный раствор используется здесь только потому, что это стерильный раствор, имеющийся в составе набора. Вместо него можно использовать стерильную воду, если она есть в наличии)

1. Подпишите чашки

Нужно подписать 40 чашек нестираемым фломастером, с обратной стороны вдоль края чашки. Не пишите на крышках. Обозначьте 16 чашек «LB», 16 «LB/amp» и 16 – «LB/amp/ara».

1. Залейте чашки

Прежде всего, залейте LB-агаром 16 чашек, обозначенных «LB». Сложите чашки стопками по 4-8 чашек. Начиная с нижней чашки, поднимите крышку, вместе со всеми стоящими на ней чашками, одной рукой, а другой залейте из колбы агар. Нужно наливать примерно на треть-половину чашки, ~12 мл. Закройте чашку и переходите к следующей. Когда закончите со стопкой, оставьте ее остывать в том же положении.

Затем, добавьте раствор ампициллина к оставшемуся агару. Быстро перемешайте. Залейте таким же образом, как описано выше, 16 чашек,подписанных «LB/amp»

Наконец, добавьте раствор арабинозы к агару, уже содержащему ампициллин. Быстро перемешайте и залейте оставшиеся 8 чашек, обозначенных «LB/amp/ara».

Чашки должны полностью застыть за 30 мин.

Внимание: при температуре >60ºC ампициллин и арабиноза будут разрушаться, но помните, что агар застывает при 27ºС. Контролируйте процесс остывания агара, и заливайте чашки от начала до конца без остановки. Для того, чтобы агар не остывал, удобно его держать на водяной бане или в термостате, поставленном на 50С. Если в только что залитые чашки попали пузыри воздуха, их можно удалить, погрев дно чашки над горелкой или просто зажигалкой (или можно быстро провести пламенем над поверхностью агара). После этого не трогайте чашки, пока они полностью не застынут. Лишний агар выбрасывайте в мусор, не выливайте в раковину. Если на чашках остались потеки застывшего агара, сотрите их.

1. Хранение чашек

После того как чашки подсохли за 2 дня при комнатной температуре, они могут быть сразу использованы, или их можно завернуть в пищевую пленку/пластиковый пакет и хранить в холодильнике. Заворачивать чашки нужно, чтобы они не пересыхали. Стопки чашек заворачиваются в полиэтиленовый пакет, переворачиваются вверх дном, и пакет заклеивается скотчем. Чашки всегда хранятся и ставятся в термостат перевернутыми, чтобы конденсат с крышки не капал на поверхность агара.

Дата добавления: 2015-10-11 | Просмотры: 742 | Нарушение авторских прав