АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Практическая работа

1. Изучить иммунный статус. Иммунодиагностика. Иммунодиагностические методы 1-го и 2-го уровня (записать в тетрадь, оформить протокол)

В иммунологии огромное значение придают лабораторным исследованиям, и в первую очередь оценке такого состояния, как иммунный статус.

Иммунный статус – комплекс количественных и функциональных показателей, отражающих конкретное состояние иммунной системы, определяемое с помощью стандартных общепринятых тестов.

Иммунодиагностика – проведение лабораторного и клинического исследования, которые помогают выявить конкретные нарушения в иммунной системе, а также позволяющие:

1) выявить нарушенное звено в функционировании иммунной системы;

2) провести анализ этиологии, патогенеза, прогноза заболевания;

3) выбрать средство иммунокоррекции;

4) провести оценку эффективности проводимой терапии, в том числе иммунокорригирующей.

Для исследования иммунной системы используют различные биологические материалы:

1) цельная периферическая кровь (как правило, венозная) является наиболее частым материалом;

2) сыворотку крови – жидкую фракцию крови, освобожденную от фибриногена;

3) плазму крови жидкую фракцию крови, содержащую фибриноген и, следовательно, способную к образованию сгустков фибрина;

4) клеточные элементы крови;

5) спинномозговую жидкость;

6) синовиальную жидкость;

7) бронхоальвеолярную жидкость;

8) выделения слизистых секретов половых органов (из канала шейки матки, влагалища, семенная жидкость);

9) выделения из носа (смывы или адсорбция на пористые материалы);

10) мочу;

11) слезную жидкость, зубодесневую жидкость и пр.;

12) супернатант с культивируемых in vitro клеток;

13) гомогенаты тканей (биопсия или post mortem);,

14) цитоплазматические и ядерные компоненты.

В настоящее время выделяют иммунодиагностические методы 1-го и 2-го уровня.

Двухуровневый принцип сводится к следующему. На первом этапе выявляют более общие («грубые») дефекты клеточного и гуморального звена адаптивного иммунитета (субпопуляции лимфоцитов, изотипы иммуноглобулинов и др.) и врожденного иммунитета (активность фагоцитов и компонентов комплемента). Для этого используют простые, но довольно точные (так называемые ориентирующие) тесты.

Иммунодиагностические методы 1-го уровня включают в себя определение:

1) относительного и абсолютного числа лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови (общепринятый анализ крови клинический);

2) относительного и абсолютного количества Т- и В-лимфоцитов, NK-клеток с использованием моноклональных антител против CD3-, CD 19- (или CD 20-, CD 72-) и CD16- CD56-маркеров соответственно;

3) субпопуляций Т-лимфоцитов: Т-хелперов (CD3,CD4) и Т-киллеров (CD3,CD8) и их соотношения (CD4/CD8);

4) концентрации сывороточных иммуноглобулинов основных классов (IgM, IgG, IgA);

5) фагоцитарной активности лейкоцитов, выработки активных форм кислорода;

6) содержания комплемента;

7) других показателей (например, цитокинов).

Минимальный набор тестов должны выполнять все лаборатории и центры клининической иммунологии, входящие в систему иммунологической службы РФ.

Иммунодиагностические методы 2-го уровня включают в себя определение:

1) относительного и абсолютного количества субпопуляций Т-лимфоцитов: Тh1 типа, Th 2 типа, Тh 3 типа;

2) фенотипических характеристик клеток иммунной системы на разных этапах иммуногенеза и иммунопоэза. Подобные исследования очень важны, например, для диагностики лейкозов и других онкологических заболеваний;

3) экспрессии активационных маркеров на поверхности иммунокомпетентных клеток. К таким маркерам относят: CD25, CD69, CD71, HLA-DR и др.;

4) оценки способности Т- и В-лимфоцитов давать пролиферативный ответ на различные стимуляторы (антигены);

5) показателей апоптоза лимфоцитов;

6) оценки концентрации цитокинов, вырабатываемых Th 1 и 2 типа (ИФН-гамма, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5);

7) активности киллерных лимфоцитов (Т-киллеров, NK-клеток и др.) с определением способности вырабатывать гранзимы и перфорин;

8) классов и подклассов иммуноглобулинов (IgM, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgE);

9) наиболее типичных цитокинов в сыворотке крови и различных биологических жидкостях;

10) различных этапов фагоцитоза и рецепторного аппарата фагоцитов;

11) других показателей.

При анализе иммунограмм чаще всего прибегают к патогенетическому принципу их интерпретации. Он основан на лабораторной оценке ключевых этапов иммунного ответа, позволяющей установить уровень патогенетического дефекта в иммунной системе. С этой целью оценивают показатели, характеризующие различные стадии развития иммунного ответа, включая распознавание, активацию, пролиферацию, дифференцировку, эффекторные механизмы, формирование иммунной памяти, регуляцию и апоптоз.

Для оценки патогенетических механизмов иммунного процесса предложены разнообразные тесты, число которых постоянно растет.

Для оценки процессов распознаванияпредложены следующие тесты:

1) взаимодействие лимфоцитов с макрофагами in vitro;

2) определение экспрессии молекул МНС класса II (презентация антигена);

3) оценка образования цитокинов (ИФН-гамма, ИЛ-4 и др.) Т-клетками при распознавании специфического антигена;

4) выявление специфических СD4 и/или CD8 Т-лимфоцитов с использованием комплексов рекомбинантных молекул.

Для оценки активации лимфоцитовопределяют:

1) экспрессию лимфоцитами и другими клетками иммунной системы маркеров активации: CD25, CD69, CD71, HLA-DR и др.;

2) внутриклеточные сигнальные молекулы лимфоцитов, в том числе внутриклеточную концентрацию ионов Са;

3) уровень провоспалительных цитокинов (ФНО-альфа, ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8 и др.) в сыворотке крови и других биологических жидкостях;

Если активация лимфоцитов блокируется до вступления в пролиферацию, то клетки подвергаются апоптозу и погибают. Такая массовая гибель активированных лимфоцитов лежит в основе феномена «апоптоза, индуцированного активацией».Этот феномен играет большую роль в патогенезе многих заболеваний человека, включая ВИЧ-инфекцию. Возникает парадоксальная ситуация: выраженная активация клеток иммунной системы приводит к развитию иммунодефицита.

Для исследования пролиферативной активности иммунокомпетентных клеток используют тесты на определение:

1) способности Т- и В-лимфоцитов усиливать пролиферацию в ответ на различную стимуляцию (митогенами, антигенами).

Оценка эффекторных функций иммунокомпетентных клеток проводится с использованием следующих тестов:

1) оценка клеточной цитотоксичности (Т-киллеры, NK-клетки и др.);

2) образование иммуноглобулинов в культуре В-лимфоцитов in vitro;

3) образование клетками иммунной системы цитокинов и ответ на них in vitro.

Цитотоксические тесты проводят, чтобы оценить способность Т-киллеров, NK-клеток, макрофагов убивать соответствующие клетки-мишени in vitro.

Определение синтеза иммуноглобулинов в культуре антитело-образующих клеток in vitro,а также в сыворотке – главные методы оценки функциональной активности В-лимфоцитов.

В настоящее время важное значение придают оценке иммунорегуляторного звена.Хотя до сих пор методы оценки числа и функций регуляторных Т-клеток трудоемки, некоторые из них находят применение в практике клинической иммунологии. Более доступны методы определения:

1) соотношения числа CD4 и CD8 Т-лимфоцитов;

2) соотношения про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке и различных биологических жидкостях;

В практической медицине используют этиологический принцип оценки иммунной системы, заключающийся в подборе определенных методов исследования, которые позволяют получить максимум информации о данной патологии исходя из этиологического фактора иммунопатологии. Например, при вирусной инфекции постановка всех тестов оценивающих иммунный статус необязательна. В этом случае, достаточную информацию дают:

1) оценка системы интерферонов;

2) исследование цитотоксических клеток (NК-клеток, Т-киллеров и др.), включая определение их количества и функциональной активности;

3) определение цитокинов, играющих важную роль в противовирусной защите (ФНО-альфа, ИФН-гамма, ИЛ-12 и др.);

4) определение специфических антител

2. Ознакомиться с правилами работы в лаборатории клинической иммунологии. Техникой обработки посуды и правила утилизации биоматериала (записать в тетрадь)

В лаборатории клинической иммунологии проводятся исследо­вания биоматериала, относящегося к группе потенциально инфицированного (кровь, суспензия клеток, сыворотка, плазма, секреты, моча и др.). Это требует соблюдения основ­ных требований техники безопасности, санэпидрежима.

a. работа с биоматериалом проводится в халатах, шапочках, перчатках;

b. на рабочем месте не должны находиться предметы, не относящиеся к работе. На рабочем столе необходимо иметь емкость с дезинфицирующим раствором и вето­шью;

c. рабочее место после работы дезинфицируется;

d. при попадании биоматериала на спецодежду или рабочую поверхность место дезинфицируется, одежда замачивает­ся в спецтаре с дезинфицирующим раствором;

e. одноразовый вспомогательный материал, использован­ные пробирки, инструменты и другие предметы, контак­тировавшие с биоматериалом, дезинфицируются в соот­ветствующих маркированных емкостях с дезинфици­рующим раствором;

f. в конце занятия рабочее место приводится в порядок, перчатки погружаются в соответствующую промаркиро­ванную емкость с дезинфицирующим раствором, моются руки;

g. провести обработку ис­пользованного оборудования: центрифугу и ионометр (по­верхности) протереть ветошью, смоченной дезинфицирую­щим раствором; объектив микроскопа иммерсионного про­тереть сухой чистой ветошью, окуляры – 70°-спиртом. Объективы установить в нерабочее положение

3. Освоение техники обработки посуды и утилизации биоматериала (записать в тетрадь):

- утилизация биоматериала:

а) сгустки крови сбрасываются в специальную маркированную емкость и засыпаются су­хой хлорной известью в соотношении 1 часть сухой хлорной извести 5 частей сгустков крови;

б) остатки слю­ны обрабатываются тем же способом;

в) остатки сыво­ротки сливаются в маркированную емкость и заливаются дезинфицирующим раствором в соотношении 1:5;

- обработка лабораторной посуды:

а) стеклянные пробир­ки после освобождения биоматериала закладываются в маркированную тару, и заливаются дезинфицирую­щим раствором и после 1 ч инкубации пробирки прохо­дят этап предстерилизационной обработки и стерилиза­ции;

б) пластиковая одноразовая посуда после обработки в дезинфицирующем растворе сбрасывается в специаль­ный пакет для лабораторных отходов;

в) пластиковая по­суда многоразового использования после обработки дезраствором тщательно промывается проточной, затем дис­тиллированной водой, подсушивается и готовится к рабо­те;

г) силиконирование посуды, предназначенной для ра­боты с клетками (раствор для силиконорования: 1 часть силикона + 10–16 частей эфира).

4. Изучить анализ и этапы лабораторных иммунологических исследований (записать в тетрадь)

Проведение анализа:

- перед постановкой анализа все реактивы выдержать при комнатной температуре не менее 30 мин.;

- при каждой постановке анализа проводить внутрилабораторный контроль качества;

- после анализа правильно оформлять регистрационные, рабочие журналы, бланки с результатами анализов. Свое­временно, согласно установленным срокам, выдавать ре­зультаты анализов врачам-клиницистам;

- получить из образца крови сыворотку (сы­воротка не должна быть хилезной, гемолизированной, в ней должны отсутствовать эритроциты и др.);

- получить пробу смешанной слюны для исследования сек­реторных иммуноглобулинов;

- провести преаналитический этап иммунологического ис­следования (маркировка, регистрация, распределение проб по тестам, хранение проб).

5. Изучить эта­пы иммунологического диагностического процесса и контроль качества лабораторных иммунологических методов исследования (записать в тетрадь)

В этой части темы студенту неободимо рассмотреть основные принципы надежности лабораторных иммунологических ме­тодов исследования. Лабораторный иммунологический диагностический процесс, как, впрочем, любой лабораторный, включает эта­пы:

1. Преаналитический (долабораторный и лабораторный)

2. Аналитический (лабораторный)

3. Постаналитический (лабораторный и внелабораторный)

Надежность лабораторных методов исследования со­ставляют три основных критерия: аналитический, медицин­ский и технико-эконо-мический (В.В. Меньшиков, 1987).

К аналитическим критериям относятся: специфич­ность, правильность, воспроизводимость и чувствительность методов исследования.

Медицинский критерий включает способ взятия биоматериала, хранение и сроки доставки его в лабораторию, условия и технологию получения проб (плазмы, сыворотки, суспензии клеток и др.), качество образцов (отсутствие при­месей фибрина, гемолиза, эритроцитов, агрегатов Ig, контаменации микроорганизмами), контроль качества методов ис­следования и др.

К технико-экономическим критериям относятся: расход рабочего времени на анализ, стоимость реактивов, их влияние на здоровье исследователей, наличие измерительной аппаратуры и возможность адаптации методов к анализато­рам, профессионализм исполнителей и др.

В табл. 27 дана характеристика некоторых этапов ди­агностиче-ского анализа.

Таблица 27

Характеристика некоторых этапов диагностического анализа

Примечание. * - Образец - часть материала пациента, предназначенного для лабораторного анализа; проба - часть образца биоматериала, исполь­зуемая для измерения в соответствующих тест-системах.

Установлено, что 70–95% ошибок в диагностиче­ском процессе в целом связаны с долабораторными этапами (В.В. Долгов и соавт., 1997).

Таким образом, контроль качества лабораторных иммунологиче-ских методов исследования – это комплекс мероприятий, включаю-щий все этапы лабораторного процесса: 1) выявление ошибок; 2) предотвращение воз­можных ошибок на контролируемых этапах; 3) своевре­менная (оперативная) ликвидация ошибок.

Контроль качества методов исследования включает: 1) систематически проводимый контроль качества всех ис­пользуемых аналитических методов сотрудниками лаборато­рии (внутрилабораторный контроль); 2) регулярно проводи­мый незави-симыми организациями внешний контроль каче­ства. Задача внешнего контроля качества – объективная оценка результатов лабораторных исследований контроль­ных образцов, предоставляемых контролирующей организа­цией. Цель внешнего контроля качества – обеспечение срав­нимости результатов, получаемых разными лабораториями.

В нашей стране государственным учреждением, уполномочен-ным проводить внешнюю экспертизу лабора­торных методов исследования, является Федеральная систе­ма внешней оценки контроля качества (ФСВОК). Временные затраты на проведение мероприятий по контролю качества составляют: в ручных вариантах методик – 12–15%, в автома­тизированных – 4–8% рабочего времени.

Надежность некоторых лабораторных иммунологиче­ских методов исследования, используемых при оценке дея­тельности иммунной системы, определяется рядом критери­ев, часть из которых входит в существующую систему кон­троля качества лабораторных исследований в целом (приказ №45 МЗ РФ). Для лучшего понимания и усвоения материала темы требуется пояснение ряда терминов и формулировок, ис­пользуемых при оценке надежности лабораторных методов (табл. 28)

Таблица 28

Характеристика терминов и критериев статистических методов, используемых при проведении иммунологических исследований

Таким образом, для обеспечения надежности лабора­торной информации при проведении иммунологических ис­следований необходимо выполнение основных принципов:

- оценка и контроль правильности проведения преаналитического этапа;

- наличие калибраторов и контрольных материалов (положительные и отрицательные);

- оценка специфичности, чувствительности, критериев правильности и воспроизводимости используемых мето­дов и материалов;

- соответствующая квалификация персонала;

- оценка точности работы оборудования (калибрующие материалы, систематичность процедуры);

- безопасность и экологическая чистота используемых ме­тодов;

- оценка правильности проведения постаналитического этапа.

6. Изучить критерии, стандартизации проводимых исследований (записать в тетрадь)

Многообразие нестандартизованных процедур, ис­пользуемых при исследованиях, требует особого внимания к вопросу унификации отдельных этапов и отработки критери­ев их стандартизации (табл. 29).

Таблица 29

Некоторые процедуры иммунологических исследований

и критерии их стандартизации

Для проведения исследований на данном этапе необ­ходима полная подготовка к работе приборов и наличие кон­трольных материалов

Контрольные материалыдолжны быть адаптированы к применяемым методикам и должны включать:

- контрольные сыворотки с различным содержанием ис­следуемых компонентов (неспецифические и специфиче­ские; IgA, IgM, IgG, IgE; СЗ, C4 и др.);

- калибраторы с известным и желательно различным со­держанием исследуемого компонента (не менее 3);

- контрольные образцы суспензий клеток (лимфоцитов при иммунофенотипировании);

- контрольные мазки (нормальные и патологические);

- референс-контроли (эталонные контроли) для оценки ра­боты тест-системы в целом.

Контрольные материалы исследуют так же, как и об­разцы пациен-тов.

Принципиальным для получения сопоставимых и на­дежных результатов является использование стандартизо­ванных контроль-ных материалов и реагентов, унифициро­ванных методов с крите-риями надежности, сведение к мини­муму влияния человеческого фактора. Всем этим требовани­ям отвечает автоматизирование системы анализа с програм­мой контроля качества.

Таким образом, для получения надежных результатов при использовании иммунологических методов оптималь­ным представ-ляется путь максимальной автоматизации ана­литического процесса и стандартизации пре- и постаналити­ческого этапов. Стандартизация преаналитического этапа, как было указано выше включает стандартизацию способов доставки и хранения проб (контейнер с диапазоном темпера­турного режима), унификацию пробирок (вакутейнеры, микроветы с различными антикоагулянтами), стандартизацию маркировки проб, растворов для подкисления или подщелачивания используемых в работе буферных растворов, уни­версальность коагулянтов, отмывающих и разводящих рас­творов и т.д.

Постаналитический этап связан с анализом резуль­татов исследования контрольных материалов, проб пациента их статистической обработки, построения контрольных карт. Наиболь-шее распространение получила карта Шухарта (кон­троль правиль-ности и воспроизводимости). Помимо непо­средственной работы по контролю качества, необходимо проведение работы по оформлению результатов исследова­ния проб пациентов (отражение в рабочем журнале, направи­тельных бланках или использование компьютерной про­граммы). Контроль качества включает следующие этапы:

1-й этап – постановка и ежедневное измерение контрольного материала исследуемых образцов пациентов в течение 20 дней.

2-й этап – статистическая обработка данных: вы­числение средней (межсерийная воспроизводи­мость).

3-й этап – по результатам статистической обработ­ки данных построение контрольной карты Шухарта.

4-й этап – по мере постановки анализов внесение результатов измерения контрольных материалов на карте Шухарта.

Построение новой карты Шухарта проводится при следующих условиях: 1) при смене серии контрольных мате­риалов, 2) после измерения настройки приборов, 3) при за­мене одного из компонентов технологии метода, 4) при не­удовлетворительных результатах анализа контрольных мате­риалов (критерии Вестгарда).

7. Проанализировать характеристику и причины возможных ошибок при постановке лабораторных исследований (записать в тетрадь)

При получении неудовлетворительных результатов контрольных измерений необходимо проанализировать воз­можные ошибки и устранить их. В табл. 30 представлена ха­рактеристика наиболее часто встречающихся причин анали­тических ошибок при проведении, например, методов РИД и ИФА.

Таблица 30

Характеристика наиболее часто встречающихся причин аналитических ошибок при проведении РИД и ИФА

Таким образом, основным правилом работы лабора­тории является проведение внутрилабораторного контроля качества по описанным выше критериям. Внешняя эксперти­за лабораторных исследований обязательна для всех лабора­торий и не заменяет внутрилабораторного контроля качества. Внутри лабораторный контроль выявляет преимущественно случайные ошибки, внешний – систематические ошибки исследований лаборатории. Ряд фирм, включая отечественные, представляет компьютерные программы по проведению кон­троля качества лабораторных исследований.

8. Определить воспроизводимость (В) результатов ИФА (записать в тетрадь оформить протокол)

10 образцов сыворотки крови поставлены в 5 повторах. При этом один слабоположительный образец в 4 случаях дал положительный результат, а в 1 случае – отрицательный, и один отрицательный образец в 3 случаях дал отрицательный результат, а в 2 случаях – положительный, остальные результаты воспроизвелись все 5 раз.
Заключение: воспроизводимость (В) тест-системы ИФА при этом составит:............... %

5. Подведение итогов занятия – 5 мин

ОГЛАВЛЕНИЕ

Дата добавления: 2015-10-11 | Просмотры: 1595 | Нарушение авторских прав