АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Генетическая роль ДНК. Исследования Гриффитса, Эвери.

Трансформация бактерий. Первым прямым доказательством генетической роли ДНК послужила ее способность переносить на­следственные свойства у пневмококков. Трансформацию пневмо­кокков — Diplococcus pneumoniae, открыл бактериолог Ф. Гриф­фитс в 1928 г.

У пневмококков известны два типа штаммов, различающихся по характеру роста на плотных средах и одновременно по свойству патогенности по отношению к подопытным животным — мышам. S-форма пневмококка образует на агаре гладкие блестящие коло­нии благодаря тому, что клетки заключены в полисахаридную капсулу. S-форма патогенна для мышей, так как полисахаридная капсула предохраняет бактериальные клетки от иммунной системы зараженного животного. Мыши, которым вводили живые клетки S-формы пневмококка, погибали. По антигенным свойствам капсу­лы различают несколько типов S-форм: IS, IIS, IIIS и т. д.

Другая форма пневмококка — R-форма не имеет капсулы, образует шероховатые колонии и непатогенна для мышей. Извест­ны редкие мутационные взаимопревращения S- и R-форм. При этом мутации R- S всегда строго специфичны: IS IR,IIS IIR, IIIS IIIR и т. д.

Ф. Гриффите обнаружил, что если мышам ввести убитые нагре­ванием до 65 °С клетки формы IIIS и одновременно живые клетки формы IIR, то мыши погибают, а из их трупов выделяются клетки формы IIIS. В контрольных экспериментах мыши, зараженные только убитой формой IIIS или только живой формой IIR, не заболевали. Следовательно, живые клетки IIR трансформируются из IIR и llS в присутствии убитых нагреванием клеток IIIS, тем самым приоб­ретая свойства патогенности.

В дальнейшем другие экспериментаторы показали, что такое же превращение — трансформация типов D. pneumoniae — может происходить in vitro, т. е. в пробирке. Используя этот подход, О. Эвери, К. МакЛеод и М. МакКарти в 1944 г. идентифицировали трансформирующий агент как ДНК. ДНК, выделенная из клеток типа IIIS и добавленная в культуру клеток IIR, трансформировала часть клеток в форму IIIS, и они приобретали способность стойко передавать это свойство при дальнейшем размножении. Добавле­ние дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) — фермента, специфически разрушающего ДНК, препятствовало трансформации.Таким образом, было получено первое прямое доказательство генетической роли ДНК у бактерий. В дальнейшем предпринима­лись многочисленные попытки трансформации низших эукариот — дрожжей, водорослей, а также многоклеточных животных и расте­ний. Эти попытки оставались безуспешными до конца 70-х годов XX в., когда стала развиваться технология генной инженерии и были разработаны методы так называемой векторной трансформа­ции. В настоящее время проблема трансформации эукариот решена и роль ДНК как универсального носителя гене­тической информации не вызывает сомнения.

41.Доказательство генетической роли нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты – наследственный материал вирусов. Работы А. Херши и М. Чейз с бактериофагом Т2,

Размножение бактериофагов. Второе прямое доказательство роли ДНК в наследственности было получено при изучении раз­множения бактериофага Т2, инфицирующего кишечную палоч­ку — Escherichia coli. Бактериофаги — это вирусы бактерий. Частица бактериофага заражает клетку Е. coli. Внутри клетки образуются новые частицы бактериофага. Через 20 мин при 37 °С клетка лизируется и около 100 дочерних частиц выходят наружу. Бактериофаг состоит только из двух макромолекулярных компонентов — белка и ДНК, заключенной в головке бактерио­фага. В 1952 г. А. Херши и М. Чейз выяснили, какой из этих двух компонентов отвечает за размножение бактериофага. В этих экспериментах белок бактериофага метили радиоактивным изотопом серы 35S, поскольку серу содержат только аминокислоты метионин и цистеин, входящие в белок. ДНК метили радиоактив­ным изотопом фосфора 32Р. Около 99 % фосфора бактериофага Т2 заключено в его ДНК. Для того чтобы ввести эти радиоактивные метки в бактериофаг, им заражали бактерии, выращенные в среде, содержащей соответствующие изотопы в компонентах питательной среды.

Мечеными бактериофагами заражали клетки Е. coli, не содер­жащие 35S и 32Р. После начального периода адсорбции бактерио­фага на клетках последние тщательно отмывали, освобождая их от так называемых «теней» бактериофага — их пустых оболочек, оставшихся на поверхности бактериальных клеток. Оказалось, что при такой процедуре из культуры бактерий удаляется не менее 80 % 35S, и это никак не влияет на дальнейшее размножение бактериофага. В то же время основная масса 32Р не может быть удалена, поскольку проникает внутрь бактерий, и в дальнейшем при размножении бактериофага 32Р передается по­томству. Таким образом, именно ДНК, а не белок определяет размножение бактериофага в зараженных клетках.

Генетическую роль нуклеиновых кислот подтверждает также мутагенный эффект аналогов пуриновых и пиримидиновых осно­ваний для бактерий, а также ультрафиолетового света с длиной волны 260 нм, поглощаемой азотистыми основаниями.

42. РНК – наследственный материал РНК-содержащих вирусов. Работы Г. Френкель-Конрата и Р. Вильямса на вирусе табачной мозаики.

РНК как генетический материал. Подавляющее большинство организмов содержат ДНК в качестве генетического материала. Лишь некоторые вирусы, например вирус табачной мозаики (ВТМ), лишены ДНК и состоят из белка и рибонуклеиновой кислоты — РНК. РНК отличается от ДНК по химическому составу тем, что в ней содержится сахар — рибоза, а пиримидиновое основание тимин заменено на урацил.

Генетическая роль РНК у ВТМ была доказана в экспериментах Г. Френкель-Конрата, А. Гирера и других в конце 50-х годов XX в. Каждая частица ВТМ содержит одиночную нить РНК длиной около 6400 нуклеотидов, заключенную в белковую оболочку. Оболочка ВТМ состоит примерно из 2130 идентичных субъеди­ниц, каждую из которых составляют 158 аминокислотных остат­ков. Известны штаммы ВТМ, различающиеся по способности ин­фицировать различные формы растения-хозяина, по симптомам, которые сопровождают вирусную инфекцию, а также по аминокис­лотному составу субъединиц белка оболочки. Если отделить белок от РНК ВТМ, то РНК практически теряет инфекционность (на 99,9 %). При реконструкции вирусных частиц (смешивании РНК и белка ВТМ) они вновь становятся инфекционными. Эти особенности ВТМ и были использованы в опытах. Реконструиро­ванные вирусные частицы были получены из РНК стандартного штамма и белка так называемого штамма HR. Штаммы различа­лись аминокислотным составом белка оболочки. В отличие от штамма HR стандартный штамм не содержал гистидина и метионина.

Вирусные частицы-потомки, образовавшиеся в результате ин­фекции растений, по аминокислотному составу белка оболочки и другим признакам всегда соответствовали тому штамму ВТМ, от которого брали РНК. Таким образом была показана роль РНК как носителя генетической информации у ВТМ.

Итак, свойство наследственности оказалось связанным с нукле­иновыми кислотами, и прежде всего с ДНК.

43. Модели удвоения молекулы ДНК. Экспериментальное доказательство полуконсервативной модели синтеза ДНК. Работа М. Мезельсона и Ф. Сталя. В 1975г. Дельбрук и стент предложили 3 модели удвоения днк: 1.консервативную-предпологала, что при синтезе днк, раскручивание спирали не происходит и родительская 2-я спираль служит матрицей для 2-х новых цепей. В результате дочерние днк строятся из нового материала, а родительская сохраняется как таковая. 2.дисперстная-распад исходной молекулы днк на фрагменты. Синтез новых цепей происходит на фрагментах, которые затем соединяются с отрезками нового материала. Каждая цепь днк должна состоять из нового материала и из чередующегося отрезка старого. 3.полуконсервативный-родительская днк раскручивается и на каждой цепи днк образуется новая комплементарная цепь. Дочерняя молекула является точной копией родительской молекулы днк. При этом 1-на цепь от материнской днк, а вторая синтезируется заново. Опыты Мезельсона и Сталя: Чтобы определить каким же из этих способов реплицируется днк надо уметь отличить родительскую днк от дочерней такой опыт провели Мезельсон и Сталь в 1975г. Они выращивали E.coli на питательных средах содержащих изотоп N15 вместоN14. N15-тяжелый изотоп. Он служил меткой включения днк. Для того чтобы пометить N15 всю бактерию днк необходимо получить примерно 12 поколений E.coli. Молекулы содержащие N15 легко отличить от N14 по плотности. Они тяжелее. При центрифугировании в градиенте плотности хлористого цезия молекула днк собирается в том слое в котором плотность раствора=их собственной плотности. Таким образом 2-ве молекулы днк отличающиеся по плотности легко разделяются. Спустя 12 поколений, которые культивировались на среде с тяжелым изотопом N15, перемещали на среду содержащую N14.через определенный период времени выделенные пробы из культуры с определенной плотностью днк было показано, что после 1-го деления бактерий на среде с N14 плотность культуральной днк была промежуточной между днк с N15 и N14. После 2-го деления половина имела легкую днк, а другая промежуточную. Таким образом соотношение между числом генераций и распределением плотности днк в точном соответствии полуконсервативному типу репликации днк. Кроме того согласно этой модели днк с промежуточной последовательностью должна содержать собственную гибридную 2-ю спираль:1-на из цепей которой содержит только N14, а другая только N15. Мезельсон и Сталь проверили это. Они нагревали днк промежуточной плотности в течении 30 минут при 100 градусах, что уже как было известно не разрывает фосфодиэфирные связи, а разрушает водородные связи. Авторы обнаружили, что при таких условиях промежуточное днк превращается в 2-ве равные по объему фракции днк с разными плотностями.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 1889 | Нарушение авторских прав