АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Бактериофаг как генетическая система

Практически все генетические эксперименты с фагами выполняются без непосредственного наблюдения над родителями и потомством. Для определения фенотипов изучаемых генетических вариантов используют косвенные методы. Как уже говорилось в гл. 4, присутствие фагов обычно устанавливают по их способности убивать заражаемые ими бактерии. О присутствии фагов свидетельствуют стерильные пятна (их называют также негативными колониями или бляшками) в сплошном слое бактериальных клеток на поверхности чашки Петри (рис. 6.1). Видимое на поверхности чашки прозрачное пятно - результат гибели бактериальных клеток-хозяев, зараженных потомством этого фага. Следовательно, прежде чем рассматривать генетику фагов, нам надо познакомиться с методами описания фенотипов мутантных фагов. Более углубленно генетика фагов будет рассмотрена в следующей главе.

Рис. 6.1. Бактериальный газон Е. coli В с негативными колониями (бляшками) фагов Т4 r + и Т4 rII, «Крапчатые» бляшки возникают в результате присутствия обоих генотипов. (Stent G. S., Calendar R. 1978. Molecular Genetics, 2nd éd., W. H. Freeman, San Francisco.) [Имеется перевод: Стент Г., Кэлиндар Р. 1981. Молекулярная генетика, М., Мир.]

6. Тонкая структура гена 161

Проще всего наблюдать мутации, влияющие на морфологию негативных колоний. Некоторые мутации влияют на их размер. Другие мутации могут давать либо прозрачные, либо мутные бляшки (последнее является следствием того, что от инфекции погибают не все клетки). Такие фаги, как Т2, Т4 и фХ174, убивающие все инфицированные клетки и соответственно дающие прозрачные негативные колонии, называются вирулентными фагами. Фаги лямбда и Р1 не всегда убивают клетку-хозяина; стерильные пятна, образуемые ими, бывают мутными, а сами фаги называются умеренными; они могут существовать внутри бактерии-хозяина в качестве профага, не вызывая ее лизис.

Фаги, заражая бактериальные клетки, прежде всего прикрепляются к специальным рецепторам на поверхности клеток. Природа этих рецепторов генетически контролируется клеткой, и можно выделить мутантные штаммы бактерий, у которых рецептор видоизменен таким образом, что фаг адсорбироваться не может. Мутации фага, дающие ему возможность прикрепляться к бактериям, к которым фаг дикого типа прикрепиться не может, позволяют выделить гены, ответственные за адсорбцию. Мутации, изменяющие морфологию негативных колоний, "и мутации, влияющие на адсорбцию фага, исследовались в числе первых; однако они составляют лишь небольшую часть генома фага.

Большая часть фаговых генов контролирует функции, наобходимые для репликации и производства потомства. Мутации этих генов препятствуют появлению потомства и, следовательно, детальны-негативных колоний не образуется вовсе. Летальные мутации фагов, если не считать некоторых специальных обстоятельств, не могут широко распространяться подобно рецессивным леталям у многих эукариот, поскольку фаги гаплоидны. Условно летальными мутациями называются мутации, летальные при одних условиях (называемых непермиссивными или рестриктивными) и не влияющие на размножение фагов в других условиях (пермиссивных). Эти мутации позволяют идентифицировать и изучать большую часть генов фага. Первыми условно летальными мутациями, изученными в генетике фагов, были rII -мутации фага Т4.

Система rII бактериофага Т4

Классический анализ тонкой структуры гена был проведен Сеймуром Бензером на rII -мутантах фага Т4 в 50-х годах. Бензер использовал два селективных преимущества этих мутантов.

Во-первых, rII -мутанты можно отобрать в большом количестве, поскольку при посеве на Е. coli В их негативные колонии имеют очень характерную морфологию. Эти мутанты вызывают быстрый лизис клеток-хозяина, в результате чего их негативные колонии получаются намного крупнее, чем при заражении фагом дикого типа (рис. 6.1). На чашке Петри одна-единственная бляшка rII легко может быть выделена из 2000 бляшек типа rII ⁺. Использование химических мутагенов сильно повышает частоту мутаций rII по сравнению со спонтанной; соответственно независимо могут быть выделены сотни мутантов rII.

Во-вторых, Бензер обнаружил, что rII -мутанты не дают потомства, когда они инфицируют клетки Е, coli К (λ), содержащие профаг λ. rII мутанты прикрепляются к таким клеткам и вводят в них свою ДНК, но инфицированные клетки погибают, не продуцируя фагового потомства.

162 Организация и передача генетического материала

В то же время фаг Т4 дикого типа (rII⁺) нормально размножается в Е. coli К (λ). Это была первая условно летальная система, исследованная в генетике фагов (табл. 6.1). Неспособность rII -мутантов к росту в Е. coli К (λ) дает удобный способ отбора, поскольку на чашке Петри таким способом можно выделить один rII ⁺ -фаг из 10⁶ rII -фагов. Следовательно, имеется возможность идентифицировать фаги дикого типа, возникающие в результате рекомбинации между двумя различными rII -мутантами.

На рис. 6.2 представлена схема эксперимента по скрещиванию бакте-

Рис. 6.2. Схема скрещивания двух мутантных фагов, А и В. Скрещивание осуществляют путем совместного заражения бактерии-хозяина в пермиссивных условиях.

6. Тонкая структура гена 163

риофагов. Клетки пермиссивного хозяина (штамма В) заражают двумя мутантами, затем подсчитывают общее число потомков при высеве на клетки штамма В и число rII⁺ -рекомбинантов. Для этого в качестве хозяина используют штамм К (λ). Так как реципрокные рекомбинанты, т. е. двойные мутанты rII, при этом не выделяются, то считают, что частота их появления совпадает с частотой рекомбинантов дикого типа. Поэтому при расчете расстояния на генетической карте число рекомбинантов дикого типа умножается на два:

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 1259 | Нарушение авторских прав