Рис. 13.8. Синтез in vitro радиоактивной цепи ДНК (цветная линия) при действии ДНК-полимеразы I. Совместное действие полимеризационного и экзонуклеазного центров (см. рис. 13.7) приводит к перемещению одноцепочечного 3'-ОН/5'-РО4-разрыва вокруг показанной на рисунке кольцевой матричной цепи. Поэтому данный процесс называется ник-трансляцией (т.е. перемещением разрыва).
Помимо этого ДНК-полимераза I является необходимым компонентом важнейшего метода определения последовательности ДНК, который называют «методом терминации цепи». Для установления последовательности ДНК, как обсуждалось в гл. 9, необходимо получить серии радиоактивно меченых перекрывающихся фрагментов, причем в рамках каждой серии все фрагменты должны начинаться с одной общей точки и статистически распределяться по длине таким образом, чтобы на противоположном конце каждого фрагмента находилось основание одного определенного (для данной серии) типа - А, Т, G или С. В этом методе серии перекрывающихся фрагментов получают с помощью ДНК-полимеразы I по одноцепочечной ДНК-матрице с использованием небольшого затравочного олигонуклеотида (праймера), комплементарного определенному участку матрицы, и радиоактивных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Для каждой матрицы проводят четыре независимые реакции полимеризации, при этом каждый раз
в реакционной смеси содержится некоторая доля одного из четырех ди дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, встраивание которых вызывает терминацию роста цепи, что обусловлено отсутствием у встроившегося нуклеотида 3'-ОНгруппы, необходимой для осуществления следующего этапа элонгации. Например, в реакционной смеси, содержащей дидезоксиаденозинтрифосфат и четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата, в каждое положение растущей цепи, соответствующее остатку тимина в матричной цепи, будут конкурентно включаться и дезоксиаденозин, и дидезоксиаденозин. В тех случаях, когда будет происходить включение дидезоксиаденозина, дальнейший рост цепи на данной матрице будет уже невозможен. При включении дезоксиаденозина полимеризация будет продолжаться без помех вплоть до следующего матричного остатка тимина, где вновь с некоторой вероятностью может произойти включение дидезоксиаденозина, приводящее к терминации цепи. Таким образом может быть получена серия всех
