АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Микроклетки и изолированные хромосомы

Селекция по типу HAT и другие способы позволяют получать стабильные клеточные линии, несущие индивидуальные человеческие хромосомы. Существуют более прямые методы, позволяющие получать гибридные клеточные линии, содержащие определенные компоненты генома человека. Это гибридизация клеток мыши с микроклетками человека, несущими неполный геном, и эндоцитоз мышиными клетками изолированных хромосом человека.

Микроклетки представляют собой хромосомы, окруженные участками ядерной и плазматической мембран. При росте клеток в присутствии колцемида через несколько дней ядро распадается на несколько микронуклеусов, каждый из которых содержит только одну или несколько хромосом (рис. 18.12). Эти клетки обрабатывают цитохалазином и центрифугируют. Таким образом, отделяется фракция микроклеток, которые представляют собой микронуклеусы, окруженные тонким слоем цитоплазмы, заключенной между ядерной и плазматической мембранами. Цитологические методы позволяют определить, какие именно хромосомы содержат полученные микроклетки. Плазматическая мембрана сохраняет рецепторы для вируса Сендай, что позволяет проводить гибридизацию клеток мыши с полученными микроклетками, используя этот вирус. Образующиеся в результате гибридизации линии клеток несут определенные человеческие хромосомы. Гены человека, экспрессирующиеся в полученных гибридных линиях, могут быть, таким образом, отнесены к определенным хромосомам.

Препарат хромосом человека, не содержащий примеси клеток, может быть получен при соответствующей обработке, вскрывающей плазматическую и ядерную мембраны клетки. В семидесятых годах были разработаны методы фракционирования и проточной микрофлуориметрии, позволяющие осуществлять сортировку хромосом на фракции, содержащие индивидуальные хромосомы человека высокой чистоты (рис. 18.13). Когда свободные хромосомы добавляют к культивируемым клеткам мыши, то эти клетки могут захватывать целые хромосомы в процессе эндоцитоза. Внутри реципиентной клетки захваченные хромосомы обычно деградируют, распадаясь на фрагменты. Если такие фрагменты содержат центромерные области, то они могут поддерживаться как единое целое. Фрагменты, лишенные центромеры, могут транслоцироваться на мышиные хромосомы. В том и другом случае определенные человеческие гены будут экспрессироваться в гибридных клетках (рис. 18.14). Встраивание фрагментов в хромосому мыши происходит с очень низкими частотами, от 10 ^–4 до 10 ^–7 на клетку. Встраиваемые фрагменты могут быть как очень мелкими, не видимыми в световой микроскоп, так и достаточно крупными, включая плечи хромосом и даже целые хромосомы. Такой перенос генетического материала от донора, сопровождающийся встраиванием в хромосомы реципиента, называется трансформацией (как у бактерий) или трансфекцией.

Картирование генов в определенных областях хромосом может быть произведено в том случае, если экспрессию изучаемого гена можно тестировать в трансформированной клетке, а встроенный фрагмент хромосомы идентифицируется цитологически. При анализе трансфициро-

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 568 | Нарушение авторских прав