АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Картирование генов с помощью ДНК-зондов

Методы картирования генов, обсуждавшиеся в предыдущих разделах, были основаны на экспрессии изучаемых генов в культурах клеток. Гены, кодирующие ферменты клеточного метаболизма, (табл. 18.2) и гены, кодирующие поверхностные антигены, такие, как белки главного комплекса гистосовместимости или антигены группы крови, удовлетворяют этому условию. Гены, не обладающие подобным фенотипическим проявлением, не могут быть картированы лишь с использованием описанных методов. Это ограничение удается преодолеть с помощью методов генной инженерии. При этом становится возможным картирование любых последовательностей ДНК, для которых можно получить соответствующий ДНК-зонд. Эти методы внесли поистине революционный переворот в генетический анализ гибридов соматических клеток.

Первое применение методов работы с рекомбинантными ДНК для картирования генов человека включало ДНК-гибридизацию в растворе. Таким образом, удалось картировать гены α- и ß-глобинов. Зонды, представляющие собой комплементарные ДНК (кДНК) этих генов, были получены с помощью обратной транскрипции очищенных α- и ß-глобиновых мРНК. Эти зонды в определенных условиях не взаимодействуют друг с другом или с глобиновыми генами мыши, но образуют стабильные дуплексы при отжиге с соответствующими последовательностями ДНК человека. Глобиновые кДНК-зонды использовали для тестирования в растворе препаратов ДНК, выделенных из различных гибридных клонов. Образование стабильного дуплекса между кДНКзондом и ДНК исследуемого препарата свидетельствовало о присутствии человеческих глобиновых генов в геноме соответствующей гибридной линии. Кариологический анализ выявленных таким образом гибридных клонов позволил заключить, что гены ß-глобинового семейства расположены в хромосоме 11, а α-глобиновые гены - в хромосоме 16.

Для проведения гибридизационного анализа в растворе требуется большое количество ДНК. Дополнительные затруднения связаны также с возможностью перекрестной гибридизации между гомологичными генами человека и мыши. Многие из этих трудностей могут быть преодолены с помощью блот-гибридизации по Саузерну. На первом этапе соответствующий ДНК-зонд метят радиоактивными изотопами (такими, как ³²Р или ³Н) с помощью ник-трансляции. Затем из гибридных линий клеток, несущих определенные хромосомы человека, выделяют препараты тотальной ДНК. Как показано на рис. 18.17, эти препараты ДНК

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 735 | Нарушение авторских прав