АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Достижения и перспективы развития современной вирусологии

Достижения современной вирусологии огромны. Ученые все более глубоко и успешно познают тончайшую структуру, биохимический состав и физиологические свойства этих ультрамикроскопических живых существ, их роль в природе, жизни человека, животных, растений. Онковирусология упорно и успешно изучает роль вирусов в возникновении опухолей (рака), стремясь решить эту проблему века.

К началу XXI века описано более 6 тыс. вирусов, принадлежащих к более, чем 2 000 видам, 287 родам, 73 семействам и 3 порядкам. Для многих вирусов изучены их структура, биология, химический состав и механизмы репликации. Продолжается открытие и исследование новых вирусов, которые не перестают поражать своим разнообразием. Так в 2003 году был открыт самый большой из известных вирусов – мимивирус.

Открытие большого числа вирусов потребовало создания их коллекций, и музеев. Наиболее крупные среди них - в России (государственная коллекция вирусов в Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского в Москве), США (Вашингтон), Чехии (Прага), Японии (Токио), Великобритании (Лондон), Швейцарии (Лозанна) и ФРГ (Брауншвейг). Результаты научных исследований в области вирусологии публикуются в научных журналах, обсуждаются на международных конгрессах организуемых каждые 3 года (впервые состоялся в 1968). В 1966 на 9-м Международном конгрессе по микробиологии впервые избран Международный комитет по таксономии вирусов (International Committee on Taxonomy of Viruses – ICTV).

В рамках общей, то есть молекулярной вирусологии продолжается изучение фундаментальных основ взаимодействия вирусов и клеток. Достижения молекулярной биологии, вирусологии, генетики, биохимии и биоинформатики показали, что значение вирусов не ограничивается только тем, что они вызывают инфекционные заболевания.

Было показано, что особенности репликации некоторых вирусов приводят к захвату вирусом клеточных генов и переносу их в геном другой клетки – горизонтальному переносу генетической информации, что может иметь последствия, как в эволюционном плане, так и в плане злокачественного перерождения клеток.

При секвенировании генома человека и других млекопитающих было выявлено большое число повторяющихся нуклеотидных последовательностей, представляющих собой дефектные вирусные последовательности – ретротранспозоны (эндогенные ретровирусы), которые могут содержать регуляторные последовательности, влияющие на экспрессию соседних генов. Их обнаружение и изучение привело к активному обсуждению и исследованию роли вирусов в эволюции всех организмов, в частности в эволюции человека.

Открытие вирусологами вирусов-сателлитов, сателлитных РНК и вироидов расширило понимание явления молекулярного паразитизма, изначально описанного для вирусов, и заставило предположить, что оно играло существенную роль в эволюции макромолекул.

Новым направлением вирусологии является экология вирусов. Обнаружение вирусов в природе, их идентификация и оценка их количества представляют собой очень сложную задачу. В настоящее время выработаны некоторые методические приемы, позволяющие оценить количество некоторых групп вирусов, в частности бактериофагов, в природных образцах и проследить их судьбу. Получены предварительные данные, свидетельствующие о том, что вирусы оказывают существенное влияние на многочисленные биогеохимические процессы и эффективно регулируют численность и видовое разнообразие бактерий и фитопланктона. Однако изучение вирусов в этом аспекте только началось, и нерешенных проблем в этой области науки еще очень много.

Достижения общей вирусологии дали мощный толчок развитию ее прикладных направлений. Вирусология превратилась в обширную область знаний, важную для биологии, медицины и сельского хозяйства.

Вирусологи осуществляют диагностику вирусных инфекций человека и животных, изучают их распространение, разрабатывают методы профилактики и лечения. Крупнейшим достижением явилось создание вакцин против полиомиелита, оспы, бешенства, гепатита В, кори, жёлтой лихорадки, энцефалитов, гриппа, паротита, краснухи. Создана вакцина против вируса папилломы, с которым связано развитие одного из видов рака. Благодаря вакцинации полностью ликвидирована натуральная оспа. Осуществляются международные программы полной ликвидации полиомиелита и кори. Разрабатываются методы профилактики и лечения гепатитов и иммунодефицита (СПИД) человека. Накапливаются данные о веществах с антивирусной активностью. На их основе создан ряд лекарственных препаратов для лечения СПИДа, вирусных гепатитов, гриппа, заболеваний, вызванных вирусом герпеса.

Изучение вирусов растений и особенностей их распространения по растению привело к созданию нового направления в сельском хозяйстве – получению безвирусного посадочного материала. Меристемные технологии, позволяющие вырастить растения, свободные от вирусов, в настоящее время применяются для картофеля, ряда плодовых и цветочных культур.

Исключительное значение на данном этапе имеют знания, накопленные о структуре вирусов и их геномов для развития генной инженерии. Ярким примером этого является использование бактериофага лямбда для получения библиотек клонированных последовательностей. Кроме того, на основе геномов разных вирусов создано и продолжает создаваться большое количество генно-инженерных векторов для доставки чужеродной генетической информации в клетки. Эти векторы используются для научных исследований, для накопления чужеродных белков, особенно в бактериях и растениях, и для генной терапии. В генной инженерии применяются некоторые вирусные ферменты, которые теперь производятся на коммерческой основе.

Малые размеры и способность к образованию регулярных структур открыли перспективу использования вирусов в нанотехнологии для получения новых бионеорганических материалов: нанотрубок, нанопроводников, наноэлектродов, наноконтейнеров, для инкапсидации неорганических соединений, магнитных наночастиц и неорганических нанокристаллов строго контролируемых размеров. Новые материалы могут быть созданы при взаимодействии регулярно организованных белковых вирусных структур с металлосодержащими неорганическими соединениями. «Сферические» вирусы могут служить наноконтейнерами для хранения и доставки в клетки лекарственных препаратов и терапевтических генов. Поверхностно модифицированные инфекционные вирионы и вирусные субструктуры могут быть использованы в качестве наноинструментов (например, в целях биокатализа или получения безопасных вакцин).
17. Титр бактериофага, методы его определения. Выявление вирусов животных и растений.

Титр бактериофага - это количество активных фаговых частиц в единице объема исследуемого материала. Для определения титра бактериофага наиболее широко в работе с бактериофагами применяется метод агаровых слоев, предложенный А. Грациа в 1936 г. Этот метод отличается простотой выполнения и точностью получае­мых результатов и с успехом используется также для выделения бактериофагов.

Сущность метода состоит в том, что суспензию бактериофага смешивают с культурой чувствительных бактерий, вносят в агар низкой концентрации («мягкий агар») и наслаивают на поверхность ранее подготовленного 1,5%-го питательного агара в чашке Петри. В качестве верхнего слоя в классическом методе Грациа использовался водный («голодный») 0,6% - й агар.В настоящее время для этих целей чаще всего применяют 0,7%-й питательный агар. При инкубации в течение 6-18 ч бактерии размножаются внутри верхнего «мягкого» слоя агара в виде множества колоний, получая питание из нижнего слоя 1,5%-го питательного агара, который применяется в качестве подложки. Низкая концентрация агара в верхнем слое создает пониженную вязкость, что способствует хорошей диффузии фаговых частиц и инфицированию ими бактериальных клеток. Инфицированные бактерии подвергаются лизису, в результате чего появляется потомство фага, которое вновь заражает нахо­дящиеся в непосредственной близости с ними бактерии. Образование негативной колонии для фагов Т-группы вызвано только одной частицей бактериофага, и, следовательно, число негативных колоний служит количественным показателем содержания бляшкообразующих единиц в исследуемом образце.

Культура чувствительных к фагу бактерий используется в логарифмической фазе роста в минимальном количестве, обеспечивающем получение сплошного газона бактерий. Соотношение числа фаговых частиц и бактериальных клеток (множественность инфекции) для каждой системы «фаг - бактерия» подбирается экспериментально с таким расчетом, чтобы на одной чашке образовывалось 50-100 негативных колоний.

Для титрования бактериофага может быть использован также однослойный метод, состоящий в том, что на поверхность чашки с питательным агаром вносят суспензии бактерий и бактериофага, после чего смесь распределяют стеклянным шпателем. Однако этот метод уступает в точности методу агаровых слоев и поэтому не нашел широкого применения.

Техника титрования и культивирования бактериофагов. Для определения титра бактериофага последовательно разводят исходную фаговую суспензию в буферном растворе либо в бульоне (шаг разведения 10^-1). Для каждого разведения используют отдельную пипетку, а смесь интенсивно перемешивают. Из каждого разведения суспензии делают «высев» фага на газон чувствительных бактерий Е. coli В. Для этого 1 мл разведенного фага вносят в пробирку с 3 мл расплавленного и охлажденного до 48-50°С «мягкого агара», после чего в каждую пробирку добавляют 0,1 мл культуры чувствительного микроорганизма (Е. coli В), находящегося в логарифмической фазе роста. Содержимое перемешивают, вращая пробирку между ладонями и избегая образования пузырей. Затем быстро выливают на поверхность агаризованной (1,5%-й) питательной среды в чашке Петри и равномерно распределяют по ней, осторожно покачивая чашку. При титровании методом агаровых слоев следует засевать параллельно не менее двух чашек одного и того же разведения фага. После застывания верхнего слоя чашки переворачивают крышками вниз и помещают в термостат с температурой 37°С, оптимальной для развития чувствительных бактерий. Учет результатов производят через 18-20 ч инкубирования.

Количество негативных колоний подсчитывают аналогично подсчету колоний бактерий, а титр фага определяют по формуле:

где N - количество фаговых частиц в 1 мл исследуемого материала; n -среднее количество негативных колоний на чашку; D - номер разведения; V — объем высеваемой пробы, мл.

В том случае, когда необходимо определить множественность инфекции, параллельно проводят определение титра жизнеспособных клеток бактерий Е. coli В в 1 мл питательного бульона. Для этого делают разведение исходной суспензии бактериальных клеток до 10^-6 и высевают ее (0,1 мл) параллельно на 2 чашки. После инкубирования при температуре 37 °С в течение 24 ч подсчитывают количество образовавшихся колоний на чашке Петри и определяют титр клеток.

Для выделения вирусов от человека, животных и растений исследуемый материал вводят в организм чувствительных к вирусам экспериментальных животных и растений или заражают культуры клеток (тканей) и культуры органов. Наличие вируса доказывается характерным поражением экспериментальных животных (или растений), а в культурах тканей — поражением клеток, так называемым цитопатическим действием, которое распознаётся при микроскопическом или цитохимическом исследовании. При В. и. применяется «метод бляшек» — наблюдение дефектов клеточного слоя, вызванных разрушением или поражением клеток в очагах накопления вируса. Вирионы, имеющие характерное строение у разных вирусов, могут быть идентифицированы при электронной микроскопии. Дальнейшая идентификация вирусов основана на комплексном применении физических, химических и иммунологических методов. Так, вирусы различаются по чувствительности к эфиру, что связано с наличием или отсутствием в их оболочках липидов. Тип нуклеиновой кислоты вируса (РНК и ДНК) может быть определён химическими или цитохимическими методами. Для идентификации вирусных белков используются серологические реакции с сыворотками, полученными путём иммунизации животных соответственными вирусами. Эти реакции дают возможность распознавать не только виды вирусов, но и их разновидности. Серологические методы исследования позволяют по наличию антител в крови диагностировать вирусную инфекцию у человека и высших животных и изучать циркуляцию среди них вирусов. Для выявления латентных (скрытых) вирусов человека, животных, растений и бактерий применяют специальные методы исследования.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 12933 | Нарушение авторских прав