АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Способы увеличения кодирующей емкости вирусного генома

Вирусам приходится паковать свой генетический материал в ограниченный объем. Поэтому физический размер геномных нуклеиновых кислот должен быть небольшим. С другой стороны, вирусам необходимо кодировать в геноме свои собственные белки, без которых их репродукция оказывается невозможной. Таким образом, вирусам необходимо решить проблему кодирования максимального количества белков в молекуле нуклеиновой кислоты минимального размера. Иначе говоря, вирусам необходимо максимально увеличить кодирующую емкость генома.

У многих вирусов молекулярная масса синтезирующихся белков превосходит теоретически рассчитанную для нуклеиновой кислоты данного размера. Этот феномен объясняется наличием в геномах вирусов особенностей, позволяющих хранить максимум генетический информации при минимальном размере генетического материала. Способами увеличения генетической информации являются перекрывание генов; сдвиг рамки считывания при трансляции; альтернативный сплайсинг мРНК; использование полицистронных мРНК; использование в мРНК нескольких инициирующих кодонов; синтез полипротеинов, которые затем разрезаются на несколько функциональных белков специфическими протеазами

75. Какие процессы обусловливают переменчивость вирусов? Модификации

Модификациями называют не наследуемые фенотипические изменения у вирусов, обусловленные клеткой-хозяином. Например, у почкующихся через плазмалемму вирусов в состав оболочки входят липиды, гликолипиды и гликопротеины хозяина и гликопротеины вируса. Например, у вируса ньюкаслской болезни птиц, выращенного в куриных эмбрионах, в состав гликолипидов оболочки входят антигены группы крови, однако после одного пассажа через куриный эмбрион они утрачиваются.

Мутации

В основе изменчивости вирусов лежат мутации, то есть изменение состава и последовательности нуклеотидов вирусного генома. Мутации происходят у всех вирусов, независимо от того, представлен ли их геном РНК или ДНК. Дальнейшая судьба вирусов с мутировавшим геномом зависит от естественного отбора.

Мутации могут иметь различные последствия. В одних случаях они приводят к изменению вирулентности вируса, либо его чувствительности к антивирусным агентам, либо к изменению его устойчивости в окружающей среде, либо другие особенности.

В некоторых случаях мутации являются летальными, так как вследствие мутации нарушается синтез или функция абсолютно необходимого для репликации вирусного белка, например репликазы. В других случаях мутации могут быть условно летальными, так как вирусный белок сохраняет свою функцию в одних условиях, но теряет в других. Типичным примером таких мутаций являются температурно-чувствительные мутации (temperature sensitive, ts), когда вирус теряет способность крепликации при повышенных температурах (39–42° С), но сохраняет эту способность при обычных температурах выращивания (36–37° С).

По своему механизму мутации могут также быть различными. В одних случаях может происходить делеция, то есть выпадение одного или нескольких нуклеотидов. В других случаях может происходить инсерция, то есть вставка одного или нескольких нуклеотидов. Также может происходить замена одного нуклеотида на другой.

Мутации могут быть прямыми и обратными. Прямые мутации изменяют фенотип, а обратные – реверсии – его восстанавливают. Возможны истинные реверсии, когда обратная мутация происходит в том же месте генома, где произошла прямая мутация, и псевдореверсия, если мутация происходит в другом участке мутировавшего гена (интрагенная супрессия) либо в другом гене (экстрагенная супрессия). При прямой реверсии ранее мутировавший белок полностью восстанавливают свою структуру. При псевдореверсии мутировавший белок восстанавливает свою функцию либо с помощью другого мутировавшего белка, либо с помощью мутации в другом месте того же белка, после которой блок, например, может восстановить свою правильную форму. Реверсия не является редким событием. По этой причине при получении мутантов с заданными свойствами, например штаммов вирусов с ослабленной болезнетворностью для получения вакцин, приходится считаться с возможностью их реверсии к дикому типу.

81. Какими методами изучают структуры вирусных частей? Размеры большинства вирионов находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа. Тем не менее, световая микроскопия является полезным методом для исследования зараженных вирусом клеток или для определения флуоресцентных красителей, связанных с молекулами антител, связавшихся с вирусными антигенами.

Особенно полезной в вирусологии может оказаться конфокальная микроскопия.

Большинство исследований структуры вирионов или зараженных вирусом клеток были проведены с использованием электронного микроскопа. Использование различных методов электронной микроскопии позволяет изучать как внутреннюю структуру вирионов, так и их трехмерное строение. Для получения трехмерных изображений используют в частности криоэлектронную микроскопию в сочетании с компьютерной томографией.

Тонкие детали трехмерного строения вирусов, вирусных нуклеиновых кислот и белков также изучают с помощью рентгеноструктурной кристаллографии. Для этого метода получают кристаллы вирионов или молекул, которые необходимо изучить. Далее кристаллы помещаются в рентгеновские лучи, которые претерпевают дифракцию благодаря повторяющемуся построению томов и/или молекул. Анализ характера дифракции позволяет установить относительные позиции молекул и атомов.

Полезную информацию относительно структуры вирусов дают также такие методы, как ядерный магнитный резонанс и атомная силовая микроскопия, электрофорез в геле агарозы или полиакриламида.

76. Какие генетические и негенетические взаимодействия наблюдаются между вирусами? Как в естественных, так и в экспериментальных условиях одна клетка может быть заражена не одним, а несколькими вирусами. При такой смешанной инфекции могут иметь место различные формы взаимодействия как между вирусными геномами, так и между продуктами генов вирусов. При взаимодействии геномов могут наблюдаться такие формы генетических взаимодействий, как множественная реактивация, рекомбинация, пересортировка генов, кросс-реактивация, гетерозиготность. При взаимодействии продуктов генов могут иметь место негенетические взаимодействия: комплементация, интерференция, фенотипическое смешивание и некоторые другие.

13.4.1. Генетические взаимодействия между вирусами

Множественная реактивация

При заражении клетки в нее могут проникнуть несколько вирусных частиц с поврежденными геномами. Каждый из этих вирионов не смог бы реплицироваться, однако вполне возможна ситуация, когда недостающий продукт гена, поврежденного у одного вириона, восполняет соответствующий неповрежденный ген другого вириона. При этом в зараженной клетке вирус успешно реплицируется, образуя полноценные неповрежденные вирионы.

Это явление вначале было обнаружено у бактериофагов и получило название множественной реактивации. В основе множественной реактивации лежит кооперативный процесс, при котором вирионы с поврежденными геномами дополняют друг друга путем генетической рекомбинации, в результате чего возникает неповрежденный вирусный геном. Эффективность множественной реактивации зависит от многих причин: степени повреждения генома вирионов, числа проникших в клетку геномов и др.

Рекомбинация

Генетической рекомбинацией называют обмен генетическим материалом между родительскими вирусами. Рекомбинация возможна в виде обмена целыми генами (межгенная рекомбинация) или участками одного и того же гена (внутригенная рекомбинация).

Пересортировка генов

Пересортировка генов является вариантом рекомбинации между вирусами, имеющими сегментированный геном. Образующиеся при пересортировке генов формы вирусов называют реассортантами. Например, с 1950-х годов получают реассортанты вируса гриппа, в частности для получения вакцины. Могут ли быть реассортанты причиной пандемий, остается дискуссионным вопросом.

Перекрестная реактивация

Перекрестная реактивация, или кросс-реактивация, происходит в случае заражения клетки двумя вариантами вирусов, при этом один вариант имеет поврежденный геном, а другой нет. При смешанной инфекции между вирусами возможна рекомбинация неповрежденных участков генома вируса с поврежденным геномом и полноценного вируса. В результате появляются штаммы вирусов со свойствами обоих родителей.

Гетерозиготность

При совместном культивировании вирусов могжет происходить формирование вирионов, содержащих в своем составе два разных генома или по крайней мере часть второго генома. Это явление названо гетерозиготностью. Впервые это было найдено у бактериофагов. Однако такое событие часто наблюдается у вирусов животных; более того, у вирусов животных, которые размножаются почкованием, в одной оболочке часто оказываются несколько нуклеокапсидов. Такой вирус можно назвать полиплоидным, а если геномы нуклеокапсидов происходят от разных родителей, то это можно назвать гетероплоидией. Следует отметить, что возможность гетероплоидии может значительно затрудняет генетический анализ вирусов, поскольку ее результат практически невозможно отличить от рекомбинации.

13.4.2. Негенетические взаимодействия между вирусами

Комплементация

Комплементация, или дополнение, является видом негенетического взаимодействия между вирусами, при котором при совместном заражении клетки двумя вирусами стимулируется репродукция одного или обоих партнеров. Генотипы вирусов при этом не изменяются, то есть не происходит никаких рекомбинаций. Суть комплементации состоит в том, что один вирус снабжает партнера недостающими компонентами, обычно структурными или неструктурными белками.

Комплементация может быть двусторонней и односторонней. При двусторонней комплементации каждый из партнеров не способен к самостоятельной репликации, и только вместе они успешно реплицируются. При односторонней комплементации один из партнеров обеспечивает другого недостающим продуктом. Комплементация наблюдается как между родственными вирусами, так и между неродственными вирусами. Примером односторонней комплементации с участием неродственных вирусов является репликация вирусов-сателлитов в присутствии вируса-помощника.

Фенотипическое смешивание

При совместном культивировании двух вирусов может наблюдаться феномен фенотипического смешивания, когда потомство приобретает фенотипические признаки обоих родителей, хотя генотип при этом не изменяется. Обычно фенотипическое смешивание может происходить между вирусами, имеющие некоторые общие черты, например структуру капсида, или которые почкуются на одной и той же мембране хозяина. При этом, например, геном одного вируса может оказаться заключен в капсид, частично или полностью состоящий из белков другого вируса.

Интерференция вирусов

Интерференция вирусов – это тип негенетического взаимодействия между вирусами, при котором наблюдается репродукция одного вируса другим в клетках, зараженных двумя вирусами. Проявляется интерференция на разных стадиях вирусной инфекции и может быть обусловлена конкуренцией за клеточные рецепторы, за участки репликации нуклеиновой кислоты и трансляции, истощением метаболитов в клетке, индукцией интерферона и другими причинами.

79. Как вирусы могут приобрести гены хозяина? Ассоциации вирус-хозяин, которые существуют в течение длительного времени, вероятно развиваются в сторону таких взаимоотношений, при которых вирус наносит хозяина слабый вред, или не приносит вреда вообще. Примерами таких вирусов являются депендовирусы и некоторые реовирусы, которые не ассоциированы ни с каким заболеванием. Вероятно, члены этих групп вирусов, которые заражают Homo sapiens, сопутствуют людям с момента выделения человека в отдельный вид.

Когда вирус начинает заражать нового хозяина, он часто становится намного более вирулентным для нового хозяина, чем был для старого. Примерами являются вирус иммунодефицита шимпанзе и вирус иммунодефицита темно-коричневых мангобеев, которые авирулентны для своих хозяев, но при переходе на человека и преобразовании в ВИЧ-1 и ВИЧ-2 они оказались летальными для нового хозяина.

Вирулентный вирус может влиять на эволюцию своего хозяина, исчезновение генов, которые обусловливают восприимчивость к вирусной инфекции, пока отбор будет благоприятствовать генам устойчивости. ВИЧ-1 в настоящее время оказывает давление отбора в пользу делеции размером 35 нуклеотидов в гене CCR5, который поддерживает восприимчивость к заражению.

Завершение коэволюции вируса и его хозяина происходит тогда, когда геном вируса встраивается в геном хозяина. Вероятно, это произошло, когда по крайней мере некоторые последовательности эндогенных ретровирусов/ретротранспозонов появились в геномах эукариот.

Геномы прокариот также содержат последовательности, которые являются результатом интеграции вирусных геномов в процессе лизогении. Последовательности фагов (профаги) обнаружены в большинстве геномов бактерий, которые были секвенированы. Некоторые из этих профагов являются индуцируемыми, то есть они могут активироваться, вирус начинает реплицироваться и клетка хозяина лизируется. Другие профаги являются дефектными, и их репликацию индуцировать нельзя. Гены, связанные с рядом особенностей бактерий кодируются последовательностями профагов, например синтез холерного токсина у Vibrio cholera.

77. Какую роль играют мутации в эволюции вирусов? При копировании геномов вирусов полимеразой происходят некоторые ошибки. Если эти ошибки происходят в последовательности, кодирующей белок, и если ошибка приводит к замене аминокислоты в белке, то ошибка приводит к мутации. Естественный отбор сохраняет те мутации, которые обеспечивают вирусу лучшую приспособленность.

Есть много видов давления естественного отбора на вирусы. Один из таких видов включает иммунный ответ хозяина; например, новый вариант антигена вируса животного, с которым иммунная система хозяина ранее не встречалась, будет иметь преимущество при сравнении с типом антигена, против которого у хозяина имеется приобретенная устойчивость. Таким образом, имеется сильно давление отбора на вирусные белки, например белок gp120 ВИЧ-1, которые являются мишенями иммунного ответа хозяина. Такие белки вируса часто являются наименее консервативными, наиболее вариабельным является участок белка, являющийся мишенью для антитела. У эволюционного процесса, однако, есть ограничения. Белки прикрепления вируса должны сохранять конфигурацию, которая позволяет им связываться с рецептором, а ферменты, типа обратной транскриптазы, должны сохранять свои каталитические свойства. Для некоторых вирусов имеются дополнительные ограничения. Например, такие вирусы как вирус желтой карликовости картофеля, которые должны реплицироваться как в растение-хозяина, так и в насекомом-хозяине, могут претерпевать только такие мутации, которые повышают их способность к репликации в одном хозяине и как минимум не снижают их способность реплицироваться в дром хозяине.

При репликации ДНК-геномов вирусов количество ошибок намного меньше, че при репликации РНК-геномов. Это связано с тем, что ДНК-зависимая ДНК-полимераза имеет механизм исправления ошибок спаривания комплементарных оснований, тогда как РНК-полимераза и обратная транскриптаза такого механизма не имеют. В результате этого ДНК-содержащие вирусы эволюционируют гораздо медленнее, чем РНК-содержащие вирусы.

Большое число ошибок при репликации РНК и обратной транскрипции означает, что РНК-содержащие вирусы не имеют какой-то фиксированной последовательности оснований в геноме. Вместо этого, вирусные геномы представлены большим количеством вариантов; для описания группы вариантов, которые в совокупности представляют геном РНК-содержащего вируса, предложен термин «квазивид». У многих ваиантов наблюдается только скоротечное существование, тогда как лучше всего приспособленные к конкретной нише начинают в этой нише доминировать.

Первым шагом в репликации геномов ВИЧ является обратная транскрипция, при которой происходи примерно одна ошибка на 10⁴ добавленных нуклеотидов. Поскольку геном ВИЧ содержит около 10⁴ оснований, это означает, что в среднем происходит одна ошибка при обратной транскрипции одного генома. Имеются доказательства, что вирусы иммунодефицита человека перешли на людей с шимпанзе и обезьян семейства мартышковых. После перехода на новый вид, вирусы быстро эволюционировали на многие субтипы и суб-субтипы.

Быструю эволюцию ВИЧ можно наблюдать в теле зараженного человека, в котором каждый день продуцируется от 10¹⁰ до 10¹² новых вирионов. Таким образом, происходит постоянное создание огромного количества новых генетических вариантов вируса. Благодаря этому, вирус быстро эволюционирует в ответ на давление отбора, такое как присутствие антивирусных лекарств.

Высокое разнообразие также выявлено в геномах других РНК-вирусов, таких как вирус гепатита С, у которого изоляты, выделенные у одного пациента, имеют до пяти процентов различий в нуклеотидной последовательности.

Способность к быстрой эволюции РНК-вирусов создает практические проблемы в развитие и поддержании некоторых программ по вакцинации. Так, при вакцинации ослабленным вирусом полиомиелита вакцина, представленная одним или более штаммами, вводится в кишечник, и инфекция в норме остается в теле 1–2 месяца. Однако у некоторых вакцинированных людей с иммунодефицитом инфекция остается в течение гораздо более длительного времени, и в течение этого времени вирус всегда эволюционирует. Поскольку между штаммами вируса полиомиелита, вирулентными для нервных клеток, и штаммами вакцины имеется различие только в несколько оснований, реверсия к нейровирулентному типу является общим явлением, и у таких людей может разиться паралитический полиомиелит, также они становятся источником инфекции вируса паралитического полиомиелита для окружающих.

Вирус гепатита В является ДНК-содержащим вирусом, однако поскольку репликация его генома включает обратную транскрипцию, частота ошибок при репликации является такой же высокой, как и у РНК-содержащих вирусов. Хотя геном данного вируса сложный и многие мутации не позволяют вирусу реплицироваться, вариабельность генома этого вируса намного выше, чем у ДНК-содержащих вирусов, геном которых реплицируется только при использовании ДНК-зависимой ДНК-полимеразы.

78. Каким образом у вирусов перебегают рекомбинации и пересортування генов? Какую роль играют эти процессы в эволюции вирусов? Рекомбинация является процессом, результатом которого является образование нового генома, имеющего происхождение от двух родительских геномов. У вирусов рекомбинация может происходить, когда клетка заражена двумя родственными вирусами. Рекомбинация может происходить в у ДНК-, и у РНК-содержащих вирусов. При рекомбинации ДНК-содержащих вирусов происходит разрезание родительских ДНК с последующим сшиванием рекомбинантов (слайд).

Геномы РНК-содержащих вирусов могут претерпевать рекомбинацию аналогичным способом.

Для вирусов, содержащих одноцепочечную РНК, полагают, что рекомбинация может происходить с помощью механизма переключения матрицы. При этом РНК полимераза транскрибирует одну молекулу РНК, далее она перемещается на другую молекулу РНК и продолжает синтез с использованием новой матрицы (слайд).

Рекомбинация также является обычным событием у ретровирусов и гепадновирусов (параретровирусов). Вероятно она происходит в процессе обратной транскрипции посредством механизма переключения матрицы. У ретровирусов матрицы РНК находятся в вирионе, и РНК разных штаммов могут оказаться в одном вирионе при совместном заражении клетки двумя штаммами вируса и последующей сборке вирионов. У параертровирусов матрицы РНК разных штаммов находятся в цитоплазме клетки.

Рекомбинации у вирусов постоянно происходят в природе; их также индуцируют в лаборатории например для получения штаммов вирусных векторов, несущих необходимые гены.

82. Какие методы используют ради идентификации вирусов и их геномов? 15.5. Изучение генетики вирусов

15.5.1. Последовательности геномов

Использование методов анализа последовательности геномной нуклеиновой кислоты позволяет получить много информации о вирусах. С использованием компьютерных специальных программ, в геномах вирусов обнаруживаются открытые рамки считывания и предсказываются свойства кодируемых ими белков, например являются ли белки ассоциированными с мембранами и/или какой ферментативной активностью они обладают. Идентифицируются регулирующие последовательности, например промоторы и энхансеры. На основании последовательности нуклеотидов для определенных групп вирусов строятся филогенетические отношения. В случае вспышек заболевания, анализ последовательности может позволить выявить важную эпидемиологическую информацию, например происхождение штамма, вызвавшего заболевание.

15.5.2. Манипуляции с геномами вирусов

Для манипуляций с нуклеиновыми кислотами вирусов, особенно ДНК, доступен довольно широкий круг методов. Эти методы позволяют выделить специфический фрагмент генома, клонировать этот фрагмент в бактериальной плазмиде и ввести сайт-специфические мутации в вирусный геном. Естественный процесс рекомбинации или пересортировки вирусных геномов может быть воспроизведен в лаборатории для получения новых генотипов вирусов.

15.5.3. Исследования функции и экспрессии генов

Функции гена могут быть выяснены, если его экспрессия блокирована. В многочисленных исследованиях были использованы вирусы с мутантными генами. В течение более или менее длительного времени были разработаны и используются методы работы в этом аспекте с ДНК-содержащими вирусами. Относительно недавно были разработаны соответствующие методы для РНК-содержащих вирусов. Эти методы называют обратной генетикой, и они включают обратную транскрипцию, то есть синтез ДНК на геномной РНК, внедрение мутации в ДНК, и затем транскрипция с получением геномной РНК, несущей нужную мутацию.

Помимо мутаций, для блокирования экспрессии генов используется глушение РНК, то есть защитный механизм хозяина. Для глушения генов используют короткие последовательности двухцепочечной РНК, комплементарные генам, которые требуется заглушить.

Экспрессию генов вируса и клетки хозяина изучают с использованием ДНК-микрочипа (слайд).

80. Какие методы используют с целью выделение и культивирование вирусов? 15.1. Культивирование вирусов

Вирусологам необходимы методы культивирования их объектов исследований. В подавляющем большинстве случаев это означает, что вирусы необходимо обеспечить подходящими клетками, которые они могут заразить и в которых может проходить их репликация. Бактериофаги можно обеспечить клетками бактериальной культуры, вирусы растений можно культивировать в специально выращиваемых растениях или в растительных протопластах. Вероятно, сложнее всего культивировать вирусы животных.

15.1.1. Культивирование вирусов в лабораторных животных

Вплоть до середины 30-х годов экспериментальные заражения животных или растений и ультрафильтрация являлись главными методами идентификации вирусов. Эти методы позволили выделить многие вирусы домашних животных, некоторые вирусы насекомых и растений. Однако стандартные лабораторные животные — мыши, крысы, морские свинки, кролики, невосприимчивы к большинству вирусных инфекций человека.

К середине 30-х годов с помощью лабораторных животных были открыты возбудители гриппа и герпеса. К вирусу гриппа весьма чувствительными оказались хорьки. Использование обезьян в качестве лабораторных животных позволило открыть вирусы оспы, полиомиелита, желтой лихорадки, денге.

Выбор экспериментальных животных определяется целью работы и видовой чувствительностью к изучаемому вирусу. Лабораторных животных заражают различными способами в зависимости от тропизма вируса к определенным тканям. Так, например, для культивирования нейротропных вирусов заражение производят преимущественно в мозг (вирусы бешенства, клещевого энцефалита и др.), культивирование респираторных вирусов осуществляется при интраназальном инфицировании животных (вирусы гриппа), дерматотропных (вирус оспы) – путем накожного и внутрикожного заражения. Наиболее часто используются накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное и внутримозговое заражение.

При первичном заражении животные могут не заболеть, поэтому через 5-7 дней внешне здоровых животных убивают, а из их органов готовят суспензии, которыми заражают следующие партии животных. Эти последовательные заражения называются «пассажами».

Индикацию, т.е. обнаружение факта размножения вируса, устанавливают на основании развития типичных признаков заболевания, патоморфологических изменений органов и тканей животных или другими способами, например по положительной реакции гемагглютинации (РГА). РГА основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов различных видов животных, птиц и человека за счет поверхностного вирусного белка – гемагглютинина. В настоящее время использование животных для культивирования вирусов ограничено.

Помимо очевидных проблем, связанных в том числе с вопросами биоэтики, культивирование вирусов в животных имеет еще одни недостаток. При заражении экспериментальных животных, чувствительных к тому или иному вирусу, этот последний накапливается во внутренних органах или нервной ткани, откуда его трудно выделить в чистом виде, освободив от клеточных белков.

15.1.2. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах

В середине 30-х годов австралийский вирусолог Ф. Вернет начал использовать новый для вирусологии экспериментальный объект — куриные эмбрионы (слайд). Куриные эмбрионы — практически идеальные модели для культивирования вирусов. Замкнутая полость эмбриона препятствует проникновению микроорганизмов извне, а также развитию спонтанных вирусных инфекций. Эмбрионы применяют для первичного выделения вирусов из патологического материала; для пассирования и сохранения их, а также для получения необходимых количеств вируса.

Для заражения вирусами обычно используют 10—12-дневные куриные зародыши, у которых в это время хорошо развиты оболочки — хорион-аллантоисная и амниотическая. При заражении их вирусами может развиться вирусная инфекция. При этом размножение вируса происходит в течение 3—4 дней, когда иммунитет еще не успевает развиться.

Размножение вируса в куриных эмбрионах происходит в разных частях зародыша, что связано с особенностями тропизма вируса. Размножаясь в зародышевых оболочках, вирус выделяется в аллантоисную и амниотическую жидкость, где накапливается в громадных количествах (до нескольких миллиардов вирионов в 1 мл). В дальнейшем вирус может быть осажден в центрифуге и дополнительно очищен разными методами.

Методику выращивания вируса в курином эмбрионе широко используют при промышленном культивировании. Кроме куриных эмбрионов, в некоторых случаях используются эмбрионы других птиц — уток, перепелок.

15.1.3. Культивирование вирусов в культуре тканей и клеток

Методы культивирования тканей и клеток животных были разработаны к середине прошлого века. В настоящее время большинство клеток для непрерывных культур имеют происхождение от людей или других видов животных. Непрерывная культура клеток состоит из клеток, которые стали бессмертными либо в теле, либо в лаборатории (слайд); такие клетки можно культивировать неограниченно. Широко распространенной является клеточная линия HeLa. Она была получена 8 февраля 1951 года из раковой опухоли шейки матки пациентки по имени Генриетта Лакс (англ. Henrietta Lacks), умершей от этого заболевания 4 октября того же года. Иногда трудно найти линию клеток, в которой вирус может реплицироваться. Так, долго не удавалось подобрать подходящую клеточную культуру для вируса гепатита С, однако в конечном итоге была найдена линия клеток гепатомы человека, которая поддерживала репликацию вируса.

Клетки культивируют в средах, в которые добавляют питательные элементы. Большинство сред содержит сыворотку крови животных, в которой имеются вещества, которые поддерживают рост многих линий клеток. Большое значение имеют также осмотическое давление и рН среды. Бльшинство клеток выращивают в пластиковых или стеклянных сосудах в виде единого слоя клеток, называемого монослоем. Альтернативно клетки можно культивировать в виде суспензии во встряхиваемой жидкой среде. Многие типы клеток требуют относительно высокой концентрации двуокиси углерода, которую обеспечивают в специальных инкубаторах.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 1158 | Нарушение авторских прав