АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

ЛИМФОЦИТОВ

Пролиферативную активность Т-лимфоцитов оценивают по интенсивности синтеза ДНК в ответ на стимуляцию митогеном (поликлональная стимуляция) или антигеном (моно- и олигоклональная стимуляция). В последнем слу­чае применяются распространенные антигены или аллоантигены. Митогены стимулируют пролиферацию значительной части Т-лим­фоцитов, поэтому результат оценивают обычно через 3 суток. Антиген стимулирует пролиферацию только тех Т-лимфоцитов, которые несут рецептор к нему, поэтому индуцированную антигеном пролиферацию оценивают через 5—7 суток. Для оценки пролиферативной активности Т-лимфоцитов при­меняют набор широко распространенных антигенов.

В асептических условиях из вены берется 5 – 10 мл крови в пробирку, содержащую 100 – 200 ЕД гепарина. Содержимое пробирки осторожно перемешивают и оставляют на 60 мин. в термостате при t 37°С для осаждения эритроцитов, которое м.б. ускорено добавлением декстрана, желатина и др. После инкубации в термостате надосадочный слой плазмы, обогащен­ный лейкоцитами, отсасывают в отдельную стерильную про­бирку. Определяют число лейкоцитов в 1 мл. Затем взвесь лейкоцитов разводят питательной средой 199 (содержащей 200 ЕД пенициллина и 100 ЕД стрептомицина в 1 мл) таким образом, чтобы в 1 mi содержалось 1 000000 - 2 000000 лейкоцитов, 20% аутологичной плазмы и 80% культуральной среды.

Приготовленную лейкоцитарную взвесь разливают в стериль­ные флаконы по 1 мл, добавляют 0,1 мл предварительно оттитрованного антигена и пропускают газовую смесь, содержащую 5% углекислого газа. Флаконы закрывают пробками и помещают в термостат при t 37°С на 5 – 7 дней. За это время культура лейкоцитов периферической крови освобож­дается от сегментоядерных лейкоцитов, исключая эозинофилы, и содержит преимущественно одноядерные клетки, которые идентифицируются как малые, средние и большие лимфоциты, бласты, ретикулярные клетки и макрофаги.

Интенсивность РБТЛ оценивается различными методами.

Морфологический метод заключается в подсчете в окрашен­ном мазке активированных кпеток-бластов на 1000 клеток и определении их процентного содержания. Реакция расценивается как положительная, если число активированных клеток составляет не менее 4% от общего числа культивируемых клеток; максимальное число активированных клеток при действии специфического антигена может достигать 35%.

Изотопный метод позволяет определить общую активность культур лимфоцитов путем подсчета включенного в клетки, синтезирующие ДНК, меченного ³Н -тимидина, добавляемого в культуральную среду. Результаты обычно вы­ражают в импульсах в минуту (имп/мин) и в виде индекса стимуляции — отношение радиоактивности стимулиро­ванных и нестимулированных лимфоцитов.

Достоверность РБТЛ проверяется контрольными исследова­ниями с культурой исследуемых лимфоцитов без добавления антигена (для выявления спонтанной бласттрансформации) и с культурой лимфоцитов здоровых доноров, инкубируемой с соответствующим антигеном.

Дата добавления: 2014-12-12 | Просмотры: 702 | Нарушение авторских прав