АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

В. Активация перекисного окисления липидов

Хаотропный эффект избытка жирных кислот и лизофосфатидов поддерживает активацию перекисного окисления липидов (ПОЛ), инициируемого накоплением в гипоксической клетке активных форм кислорода (АФК). Генерация последних связана с Са²⁺ - зависимым повреждением митохондрий и формированием избытка доноров электронов – восстановленных кофакторов.

Образование активных (токсичных) форм кислорода (в невозбужденном состоянии кислород нетоксичен) связано с особенностями его молекулярной структуры: О₂ содержит два неспаренных электрона с параллельными спинами, которые не могут образовывать термодинамически стабильную пару и располагаются на разных орбиталях. Каждая из этих орбиталей может принять еще один электрон. Таким образом, полное восстановление молекулы кислорода происходит в результате четырех одноэлектронных переносов:

е^- е^- е^- е^-, Н⁺

О₂ О₂^- Н₂О₂ `ОН + Н₂О 2Н₂О

Образующиеся в ходе неполного восстановления молекул кислорода супероксид (О₂^-), пероксид (Н₂О₂) и гидроксильный радикал (`ОН) – активные формы кислорода, являются окислителями, что представляет серьезную опасность для многих структурных компонентов клетки (Авдеева Л.В., Павлова Н.А., Рубцова Г.В., 2005). Особенно активен гидроксильный радикал (•OH), взаимодействующий с большинством органических молекул. Он отнимает у них электрон и инициирует таким образом цепные реакции окисления.

Основной путь образования АФК в большинстве клеток – утечка электронов из цепи их передачи (дыхательной цепи) и непосредственное взаимодействие этих электронов с кислородом (Губарева Л.Е., 2005). В качестве еще двух источников могут выступать реакции с участиемоксидаз, использующих молекулярный кислород как акцептор электронов и восстанавливающих его до Н₂О или Н₂О₂ и реакции с участиемоксигеназ, включающих один (монооксигеназы) или два (диоксигеназы) атома кислорода в образующийся продукт реакции. В условиях дефицита в тканях кислорода, т.е. в ситуации, когда «спрос» (восстановленные кофакторы) превышает «предложение» (количество молекул кислорода), вероятность усиления образования АФК резко возрастает. Инициируемые ими свободнорадикальные реакции, приводят к повреждению клеточных и субклеточных структур, включая митохондрии, молекулы ДНК и белка. И хотя вклад АФК в развитие гипоксического некробиоза (в отличие от реперфузионного синдрома) расценивается в качестве доминирующего механизма не всеми авторами (Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П., 1999), тем не менее их участие в активации свободно-радикальных процессов в клетке, включая ПОЛ, является решающим.

Следует отметить, что ПОЛ представляя собой саморазвивающуюся цепную реакцию, постоянно протекает в клетке, играя роль необходимого звена в ее жизнедеятельности и в адаптационных реакциях. Благодаря перекисному окислению в молекуле фосфолипидов клеточных мембран, содержащих во втором положении жирную кислоту, появляются полярные гидроперекисные группировки (гидроперекиси липидов), обладающие детергентным действием. Появление таких группировок увеличивает подвижность полипептидных цепей, т.е. облегчает конформационные изменения молекул белков, что сопровождается ростом активности мембраносвязанных ферментов, к которым по существу относятся все ферментные системы клетки. И лишь чрезмерная активация ПОЛ, затрагивающая более 3-5% фосфолипидов мембран, превращает его из регуляторного механизма в звено патогенеза их повреждения при клеточной гибели (Ю.А. Владимиров, 1987; 2000).

В результате активации ПОЛ, инициируемого АФК, и прежде всего – гидроксильным радикалом (•OH), происходит образование новых вторичных радикалов: липидного (L•), алкоксильного (LO•), перекисного (LOO•). Рис. 28.

Рис. 28. Перекисное окисление липидов и образование вторичных радикалов

(Ю.А. Владимиров, 2001)

Химическая активность этих вторичных органических радикалов ниже, чем у гидроксильного радикала (•OH), но они активно вовлекаются в цепную реакцию ПОЛ, поддерживая и усугубляя повреждения липидного бислоя клеточных мембран.

Модифицирующие эффекты ПОЛ в отношении фосфолипидов определяют цепь дальнейших событий (Архипенко Ю.В. с соавт., 1983; Меерсон Ф.З., 1989; Владимиров Ю.А., 2001). Прежде всего, в молекулах фосфолипидов, содержащих во втором положении жирную кислоту, появляется полярная гидроперекисная группировка (рис. 29).

При этом накопление гидроперекисей липидов сопровождается уменьшением количества ненасыщенных липидов. При умеренной активации ПОЛ, как отмечалось выше, появление в микроокружении интегральных белков полярных продуктов ПОЛ, обладающих детергентным действием, вызывает увеличение подвижности полипептидной цепи, что, как правило, сопровождается увеличением каталитической активности ферментов. При избыточной активации ПОЛ главное значение приобретает уменьшение количества непредельных фосфолипидов.

Рис. 29. Образование гидроперекиси фосфолипида, начальный этап про­цесса ПОЛ

(Ф.З. Меерсон, 1984).

· Значительное уменьшение содержания непредельных фосфолипидов в мембране под влиянием ПОЛ, повышает регидность (микровязкость) ее липидного бислоя, что сопровождается снижением конформационной подвижности полипептидных цепей белков, встроенных в мембрану (эффект «вмораживания»). Поскольку такая подвижность необходима для нормального функционирования ферментов, рецепторов и каналоформеров, их функциональный ответ ингибируется (рис. 30).

Рис. 30 Изменение активности Са-АТФазы в мембранах саркоплазматического

ретикулума в результате модификации липидного окружения этого фер­мента

процессом ПОЛ (Ф.З. Меерсон, 1984)

А - исходное состояние; Б - умеренная активация Са-АТФазы; В - ингибирование-Са-АТФазы.

· Окисленные в ходе активации ПОЛ фосфолипиды подвергаются латеральной диффузии вдоль мембраны и образуют ассоциаты (кластеры), фиксированные взаимодействием фосфолипидов между собой и молекулами воды. Эти участки мембраны приобретают гидрофильность. Располагаясь друг против друга в каждом из монослоев липидного бислоя, такие ассоциаты образуют каналы в мембране, увеличивая ее проницаемость для воды, кальция и других ионов (рис. 31).

Рис. 31. Схема образования перекисных кластеров и фрагментация мембраны при индукции перекисного окисления липидов (Ф.З. Меерсон, 1984)

Светлый треугольник — гидроперекисная группа.

· Образующиеся продукты распада гидроперекисей фосфолипидов (малоновый, глутаровый и др. диальдегиды) взаимодействуют со свободными аминогруппами мембранных белков, образуя межмолекулярные сшивки и инактивируя эти белки (рис. 32). In vivo этот процесс приводит к образованию т.н. оснований Шиффа пигмента изнашивания липофусцина.

Рис. 32. Образование сшивок и ингибирование мембранных белков-ферментов в результате активации ПОЛ (Ф.З. Меерсон, 1984)

Последний представляет собой смесь липидов и белков, связанных между собой поперечными ковалентными связями и денатурированными в результате взаимодействия с химически активными группами (диальдегидами) продуктов ПОЛ. Этот пигмент фагоцитируется, но не гидролизуется ферментами лизосом, и поэтому накапливается в клетках в виде пигментных пятен, особенно на дорзальной поверхности ладоней у пожилых людей.

Гидроперекись (2), образовавшаяся в результате реакции фосфолипидов (1) с молекулярным кислородом, распадается на фосфолипид с укороченной углеводородной цепью во втором положении, сходный с лизофосфолипидами (3) и короткий углеводородный фрагмент – диальдегид (4). Взаимодействие бифункциональной по своей природе молекулы диальдегида с аминогруппами одновременно двух молекул белков приводит к формированию сшивки (5).

· Под влиянием ПОЛ происходит окисление сульфгидрильных (-SH) групп мембранных белков: ферментов, ионных каналов и насосов, что приводит к падению их активности.

· Образование полярных продуктов окисления способствует возрастанию на мембране отрицательного поверхностного заряда, обусловливающего фиксацию на ней полиэлектролитов. Среди последних – некоторые белки и пептиды, формирующие белковые поры – один из факторов снижения электрической стабильности мембран.

· Увеличение полярности внутренней оболочки мембраны обусловливает проникновение воды в липидный бислой – т.н. «водную коррозию мембраны».

· «Выталкивание» из мембраны части окислившихся полиненасыщенных жирных кислот приводит к уменьшению площади ее липидного бислоя.

Таким образом, на этом этапе развития гипоксического повреждения клеток ключевым звеном патогенеза выступает дезорганизация липидного бислоя мембран, осуществляемая при участии ионов кальция и липидной триады: активации липаз и фосфолипаз; детергентного действия избытка жирных кислот и лизофосфолипидов, а также активации перекисного окисления липидов.

Существенный вклад в эту дезорганизацию вносят также: механическое (осмотическое) растяжение мембран и адсорбция на липидном бислое полиэлектролитов, способствующие увеличению их порозности. В совокупности указанные нарушения обусловливают снижение электрической прочности мембран и возникновение электрического пробоя липидного бислоя собственным мембранным потенциалом (рис. 33). Последний рассматривается как терминальный механизм нарушения барьерной функции мембраны (Владимиров Ю.А., 2001).

Этот этап патогенетической цепи повреждения клеток при гипоксии, характеризующийся нарастающей утратой барьерной и матричной функций мембран, определяет переход обратимых изменений в клетке – в необратимые.

Последующее развитие событий связано с формированием повреждений клеточных структур, непосредственно приводящих к клеточной гибели. Существенно, что механизмы этих повреждающих эффектов также тесно связаны с повышенным содержанием в цитозоле ионов Са²⁺.

Патогенетические последствия избытка ионов кальция в заключительной стадии гипоксического повреждения клеток (стадия некробиоза) не ограничиваются активацией липаз и фосфолипаз. Ионы Са²⁺ прямо участвуют в прямых эффектах повреждения клеточных структур и апоптотической гибели клеток. К числу этих эффектов относятся:

· Разрушение цитоскелета, которое связано с Са²⁺-зависимой активацией кальпаинов. Происходит деструкция некоторых белков цитоплазмы (β-актин, фодрин), что вызывает деформацию клеток, ограничивающую возможность их взаимодействия с микроокружением, а также способность к восприятию регуляторных сигналов. Слабость цитоскелета способствует дезинтеграции некоторых надмолекулярных комплексов в клетке, в частности, отсоединению рибосом от мембран шероховатого эндоплазматического ретикулума. В результате происходит насыщение цитоплазмы белковыми молекулами, подвергающихся деградации.

· Механическое повреждение клеточных структур, обусловленное Са²⁺ активацией сократительной функции миофибрилл с одновременной утратой ими способности к расслаблению. Такие контрактурные сокращения сопровождаются механическим повреждением сократительных структур клетки.

· Омыление и эндогенный детергентный эффект. Накопление в клетке жирных кислот в присутствии избытка ионов Са²⁺ (и Na⁺) приводит к образованию мыл – солей высших жирных кислот. По этой причине гидролиз сложноэфирных связей называется омылением. Образование мыл в цитозоле резко увеличивает его детергентную активность которая в буквальном смысле растворяет липидные мембраны (Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П., 1999). Мыла, разрушая мембраны органоидов, обрушивают на клетку удар гидролаз, активных радикалов и других метаболитов, которые до этого момента были изолированы в различных отсеках клетки. Этот эндогенный эффект имеет решающее значение в формировании финальной стадии клеточной гибели.

· Наряду с участием в некробиозе, ионы кальция участвуют в реализации механизмов апоптотической гибели клеток. Среди последних: повышение активности Са²⁺-зависимых эндонуклеаз и кальпаинов. Подобная активация несет в себе угрозу для клетки, инициируя ее апоптотическую гибель либо вследствие фрагментации ДНК (эндонуклеазами), либо в результате протеолиза антиапоптотических белков (bcl-2) кальпаинами. Апоптозу может способствовать и кальпаининдуцированная деградация протеинкиназы С(ПКС), реализующую, в основном, антиапоптотические эффекты и повышающую устойчивость клеток к токсическим продуктам обмена.

· Более того, избыток ионов Са²⁺ сам способствует образованию токсических продуктов, в роли которых могут, в частности, выступать молекулы оксида азота в высоких концентрациях, создаваемых Са²⁺-активацией индуцибельной NO-синтазы. Наиболее ярко такой эффект проявляется при т.н. глутаматной гибели нейронов, возникающей при гипоксии (ишемии мозга). Инициация развития событий в этом случае связана с дефицитом энергии в нейронах, выходом ионов калия, деполяризацией мембран и повышением внутриклеточного пула Са²⁺ в результате длительного открытия потенциал зависимых кальциевых каналов (рис. 34).

Рис. 34. Механизм развития глутаматной гибели нейронов при гипоксии

Следствием избытка ионов кальция в цитоплазме является повышенное выделение нейромедиатора (глутамата) глутаматергическими нейронами в синаптическую щель. Восприятие данного сигнала постсинаптическими нейронами осуществляется с помощью НМДА-рецепторов (наиболее хорошо изученный подтип рецепторов глутамата с высоким сродством к синтетической аминокислоте Н-метил-Д-аспартату), чувствительность которых к медиатору в условиях гипоксии значительно возрастает (Крыжановский Г.Н., 1997). Результатом «глутаматной бомбардировки» (Акмаев И.Г., 1996; Акмаев И.Г., Гриневич В.В., 2001) постсинаптического нейрона является открытие в нем ионных каналов, приводящее к увеличению поступления кальция в клетку и активация нейрональной NO-синтазы (NOS). Продуцируемый под ее влиянием оксид азота, имея малый размер и липофильную природу молекулы, диффундирует во внеклеточное пространство и поступает через мембраны в близлежащие клетки (нейроны), оказывая на них токсическое влияние. Основу этого токсического влияния составляет энергетический дефицит клеток. Механизм формирования такого дефицита связан со способностью NO вызывать S- нитрозилирование клеточных железосодержащих белков (аконитаза ЦТК, комплексы I-III цепи переноса электронов в МТХ) и их инактивацию. Кроме того, под влиянием NO происходит рибозилирование и нитрозилирование глицеральдегид-3-фосфатдегидро-геназы, обусловливающей торможение гликолиза. Наконец, при взаимодействии NO с другим радикалом – О₂^- образуется пероксинитрит-анион (ONOO^-), вызывающий необратимое ингибирование железосодержащих белков.

За счет образования ONOO^- возможно включение апоптотического механизма гибели клеток путем реализации следующего каскада:

Особенностью глутаматной гибели нейронов является отсутствие гибели самих NO-продуцирующих нейронов, оказывающихся защищенными от токсического действия NO. Механизм этой защиты связывают с активацией супероксиддисмутазы (СОД) и (или) с переходом NO в окисленную форму (NO⁺). По сути здесь прослеживается прямая аналогия с макрофагами, которые, продуцируя NO, сами проявляют к нему устойчивость.

Таким образом, гибель клетки при гипоксии представляет собой закономерное развертывание цепи событий, включающих формирование энергодефицита, ингибирование основных метаболических путей, активацию липидной триады и последующее необратимое повреждение клеточных структур. Центральным звеном патогенеза этих событий является повышение внутриклеточной концентрации ионов кальция, а главной мишенью – клеточные мембраны и, прежде всего – митохондрии.