АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

УЧЕБНИК

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

УНИВЕРСИТЕ СЕРВИСА И ЭКОНОМИКИ

М.И. Дмитриченко, А.В. Зачиняева, В.Б. Сбойчаков

УЧЕБНИК

по курсу Основы микробиологии

для студентов направления 100800.62

«Товароведение».

Санкт-Петербург

Дмитриченко А.В., Зачиняева А.В., Сбойчаков В.Б. Основы микробиологии. Учебник для студентов направления 100800.62− СПб.: Изд-во СПбГУСЭ, 2012. − 159с.

Авторы:

· к.т.н., профессор «Товароведения и экспертизы потребительских товаров» СПбГУСЭ

Дмитриченко Михаил Иванович

· д. м. н., профессор кафедры «Экономики и управления учреждениями здравоохранения» СПбГУСЭ

Сбойчаков Виктор Борисович

· д.б.н., профессор кафедры «Товароведения и экспертизы потребительских товаров» СПбГУСЭ

Зачиняева Анна Владимировна

Рецензент: д-р м. наук, проф.Лопатин С.А.

В учебном пособии предлагается применение компетентностного подхода к подготовке специалистов сферы торговли и общественного питания по обеспечению безопасности пищевых продуктов при их реализации потребителям.
Рассмотрены основы морфологии и систематики микроорганизмов, влияние на них факторов внешней среды, пищевые заболевания, вызываемые патогенными организмами. Описаны источники инфицирования пищевых продуктов микроорганизмами, микробиология пищевых продуктов.

Предисловие

Микроорганизмы повсеместно распространены в природе, что является подтверждением их значимой роли в круговороте веществ биосферы и в жизни человека. Со времен седой древности и до наших дней человек использует деятельность микробов в ряде производственных процессов.

Товароведу, технологу необходимо знать основы микробиологии, изучающей строение, жизнедеятельность, закономерности роста и развития микроорганиз-мов, их взаимодействие с внешней средой.

Микроорганизмы широко используются в пищевой промышленности в техно-логических процессах производства различных продуктов. На основе их жизне-деятельности основано производство кисломолочных продуктов, квашенных овощей, хлеба, вина и пива. От применения микроорганизмов в значительной степени зависят вкусовые качества пищевых продуктов. Микроорганизмы используются в получении многих биологически активных веществ: ферментов, витаминов, антибиотиков.

Однако наряду с полезной микрофлорой существует и группа патогенных микробов − возбудителей болезней человека. Многие из них являются возбудителями порчи различных пищевых продуктов. Микроорганизмы распространенны повсюду, этому способствуют их разнообразные потребности в пище, легкая приспособленность к условиям существования, высокая выносливость, способность к исключительно быстрому размножению.

ТЕМА № 1. Правила работы и устройство микробиологической лаборатории. Методы микроскопии. Техника приготовления микроскопических препаратов. Простые и сложные методы окраски

Знание и неукоснительное соблюдение правил работы с различными группами микроорганизмов являются гарантией отсутствия случаев внутрилабораторных заражений, а изучение техники приготовления микроскопических препаратов является основой микроскопического метода исследования.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ

Ознакомление студентов с устройством микробиологических лабораторий, изучение правил работы в них, освоение техники приготовления и микроскопического исследования окрашенных препаратов.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ

1. Определение термина «микробиология». Задачи, достижения и проблемы данной научной сферы. Связь микробиологии с другими дисциплинами.

2. Принципы организации и оборудование микробиологической лаборатории.

3. Правила работы в микробиологической лаборатории.

4. Простые и сложные методы окраски бактерий.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ

1. Содержать рабочее место в порядке.

2. Микроскопировать препараты, обнаруживать внутриклеточные включения, капсулы, элементы бактериальной клетки.

3. Работать с помощью иммерсионного объектива биологического микроскопа, с фазово-контрастной установкой и в темном поле.

4. Приготовить мазок-препарат, окрашенный простым способом по методам Грама, Циля − Нильсена.

5. Приготовить препараты для микроскопического исследования микроорганизмов в живом состоянии.

Организация микробиологической лаборатории

Микробиологические лаборатории –это лаборатории, в которых выполняют различные микробиологические исследования. Существуют 3 типа микробиологических лабораторий:

- клинико-диагностические –при больницах, диспансерах и поликлиниках:

- санитарно-бактериологические – при санитарно-эпидемиологических станциях (СЭС);

- ведомственные –при молочных, консервных заводах, мясокомбинатах, хлебозаводах, пивоваренных заводах, водонасосных станциях, станциях защиты растений и др.

Клинико-диагностические лаборатории проводят микробиологическую диагностику инфекционных болезней.

Лаборатории при СЭС осуществляют санитарный надзор на различных пред-приятиях, следят за санитарным состоянием помещений, оборудования, инвен-таря, соблюдением правил личной гигиены персоналом, а на пищевых пред-приятиях – за соблюдением санитарных правил при технологической обработке, хранении, реализации, транспортировке пищевых продуктов.

Ведомственные лаборатории в зависимости от типа производства выполняют текущие анализы по внутрипроизводственному, входному и выходному контро-лю на микробную загрязнённость сырья, полуфабрикатов и готовой продукции, занимаются разработкой методов, обеспечивающих микробиологическую безопасность производства.

Выполняя микробиологические исследования, необходимо соблюдать следу-ющие правила:

· с инфицированным материалом работают только с помощью инструментов (пинцетов, петель, корнцангов и др.);

· прикасаться руками к исследуемому материалу и конденсату в засеянных чашках запрещается;

· перед работой тщательно проверяют целость стеклянной посуды, проходимость игл и надежность поршней шприцев;

· при посеве материала делают надпись на пробирках, чашках Петри, колбах, флаконах с названием номера анализа (культуры) и даты посева;

· в пробирки и чашки Петри материал высевают вблизи от огня горелки с обжиганием петли, шпателя, краев пробирки;

· во время работы все чашки с посевами помещают в кюветы или на подносы, пробирки − в штативы;

· растворы, содержащие патогенные микроорганизмы, набирают пипеткой с помощью резинового баллона;

· насасывать ртом и переливать растворы из сосуда в сосуд через край нельзя;

· по окончании работы запрещается оставлять на рабочих столах нефиксированные мазки, чашки Петри, пробирки и другую посуду с инфицированным материалом;

· не разрешается выходить за пределы лаборатории в халатах и надевать их на верхнюю одежду.

Доставлять инфицированный материал в лабораторию и переносить его из одной лаборатории в другую на территории учреждения нужно в специально приспособленной посуде (металлических биксах, ящиках, баках).

В комнатах, предназначенных для обработки и посева инфекционного материала, нельзя проводить другие работы, выращивать цветы, держать домашних животных.

Принимать пищу, пить, курить, хранить продукты питания в помещениях, где работают с материалом, зараженным патогенными микроорганизмами или подозрительным на такое заражение, запрещается.

Центрифугирование инфекционного материала проводит специально обученный персонал. Если в процессе центрифугирования разбивается пробирка, содержащая инфекционный материал, центрифугу отключают от сети, выжидают время для того, чтобы осели капли аэрозоля, дезинфицируют, а загрязненные места очищают.

Термостаты и термостатные комнаты, предназначенные для выращивания патогенных микроорганизмов, дезинфицируют не реже одного раза в месяц.

При хранении инфекционных материалов в холодильнике необходимо принимать меры, предупреждающие его инфицирование. Оттаивание холодильника, предусмотренное правилами эксплуатации, нужно совмещать с его дезинфекцией.

В лаборатории обязательно должна быть укомплектованная аптечка для экстренной медицинской помощи, включающая этиловый спирт, настойку йода, перевязочные средства, набор необходимых антибиотиков.

Использованные при лабораторных исследованиях предметные стекла, пипетки, шпатели погружают на сутки в банки с дезинфицирующим раствором, затем моют и кипятят.

Отработанные чашки Петри и пробирки с посевами культур, посуду с использованным материалом, собирают в банки с крышками и стерилизуют паром под давлением;

Бактерицидные лампы включают только в отсутствие персонала;

Руки тщательно моют с туалетным мылом, вытирают вафельным полотенцем и смазывают защитным питательным кремом.

Методы микроскопии. Техника приготовления микроскопических препаратов. Простые и сложные методы окраски

В связи с малыми размерами большинства патогенных микроорганизмов (!не более 2-30 мкм) изучение их морфологии возможно только с помощью специальных оптических приборов, получивших название микроскопы (от греч. микрос − малый и скопейн − рассматривать, наблюдать). Они дают значитель-ное увеличение и обладают высокой разрешающей способностью, то есть наименьшим расстоянием между двумя точками, дающими в поле зрения раз-дельное изображение.

Разрешающая способность человеческого глаза превышает 80 мкм. Размеры патогенных микроорганизмов меньше указанной величины, поэтому мы их не видим. Более того, микроорганизмы, расположенные друг к другу ближе 80 мкм, раздельно не воспринимаются. Современные микроскопы позволяют по-лучать раздельное увеличенное изображение микроорганизмов и других объек-тов и структур, не доступных невооруженному человеческому глазу.

В настоящее время в практике микробиологических исследований исполь-зуют несколько типов микроскопов (биологический, люминесцентный, исследо-вательский, электронный) и специальные методы микроскопии (темнопольный, фазово-контрастный).

Биологический микроскоп

Для микроскопических исследований применяют биологические микроскопы отечественных моделей: БИОЛАМ Р-11, БИОЛАМ Р-15, БИОЛАМ 17, БИОЛАМ С-11, БИОЛАМ П-1, БИОЛАМ И (микроскопы Р − рабочие, С − студенческие).

Современный биологический микроскоп — сложный оптический прибор, позволяющий изучать объекты в проходящем свете, в светлом и темном поле, а также в отраженном свете. Все эти микроскопы обеспечивают достаточно боль-шое увеличение и высокую разрешающую способность (до 0,4 мкм).

Биологический микроскоп состоит из двух систем − механической и опти-ческой (рис.1).

Механическая система микроскопа включает: а) штатив; б) колонку; в) тубус (съемный, наклонный − в современных моделях); г) подвижный предметный столик; д) макрометрический винт для грубой (ориентировочной) настройки на резкость; е) микрометрический винт, обеспечивающий тонкую фокусировку препарата; ж) револьвер для объективов.

Оптическая система микроскопа содержит две части – осветительную и наблюдательную. Осветительная часть состоит из зеркала и конденсора с ирисовой апертурной диафрагмой. Зеркало имеет две отражательные поверх-ности – плоскую и вогнутую. С помощью конденсора лучи, идущие от зеркала, фиксируются и направляются на препарат. Яркость освещения регулируется ирисовой диафрагмой.

Рисунок 1. Устройство микроскопа

Оптическую часть микроскопа составляют объектив и окуляр. В микроскопах с наклонным тубусом имеется специальная призма, направляющая лучи под уг-лом 45⁰ к вертикали.

Объективы микроскопа отличаются сложным устройством и состоят из нескольких отдельных линз – фронтальной (нижней) линзы, увеличивающей объект, и коррекционных, исправляющих недостатки оптического изображения. Обычно применяют ахроматические объективы, в которых устранена хромати-ческая аберрация в отношении наиболее ярких цветов спектра (окрашивание изображения в различные цвета благодаря различной преломляемости лучей с различной длиной волны) и сферическая аберрация (нечеткое изображение периферических частей рассматриваемого предмета). Апохроматические объек-тивы дают отчетливое, почти бесцветное изображение, поэтому они особенно эффективны при микрофотографировании (в них достаточно устранен остаточ-ный хроматизм и достигнута равномерность резкости и величины изображения в лучах с разной длиной волны). Подобную оптику имеет БИОЛАМ Р-17 (объективы-апохроматы 10x, 20x, 60x, 90x МИ).

Объективы разделяют на сухие и иммерсионные (от лат. Immersio − пог-ружение). Обычно биологические микроскопы оснащают двумя сухими объек-тивами (8x и 40x) и одним иммерсионным (90x МИ), однако последние модели помимо указанных объективов оснащены более совершенной и разнообразной оптикой (БИОЛАМ Р-17 – апохроматами, БИОЛАМ И – планапохроматами). Данные о каждом объективе обозначены на его оправе; к ним относятся: а) по-казатель увеличения x8, x40, x90; б) численная (нумерическая) аппертура; в) за-водской номер объектива. Наряду с этими обозначениями иммерсионные объективы x90 (x100 БИОЛАМ И) имеют дополнительный буквенный индекс ОИ или МИ (объектив иммерсионный или микроскоп), а также черную марки-ровочную линию в нижней части объектива (рис.2).

Рисунок 2. Ход лучей в обычном объективе и объективе с иммерсией

Фронтальная линза иммерсионного объектива имеет короткое фокусное рас-стояние – 1,5-3 мм. При микроскопии ее погружают в каплю предварительно нанесенного на препарат иммерсионного масла, показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла – 1,52. При этом устраня-ются неизбежные потери света при попадании в объектив.

Окуляры состоят из двух линз: верхней − глазной и нижней − собирательной. На оправе окуляров обозначено увеличение: x5 (22 мм), x7 (18 мм), x10 (13 мм), x15 (11 мм). Окуляры подобны лупе и лишь увеличивают изображение, полу-ченное объективом микроскопа.

Общее увеличение микроскопа определяют произведением увеличений объектива и окуляра. Например, увеличение микроскопа с иммерсионным объективом x90 и окуляром x10 составляет: 90 х 10 = 900 раз. Полезное уве-личение микроскопа может достигать 1500 раз, в повседневной же практике обычно используют увеличение порядка 630-900 раз.

Для полного использования разрешающей способности микроскопа необ-ходимо хорошо знать его устройство и, прежде всего, правильно осветить ис-следуемый объект. Освещение объектов может быть осуществлено естест-венным (дневным) или искусственным светом (БИОЛАМ Р-11, БИОЛАМ Р-15, БИОЛАМ Р-17, БИОЛАМ С-11), во многих моделях микроскопов предус-мотрено исследование объектов только при искусственном свете, так как они оснащены встроенным осветителем, в котором источником света являются лампы КГМН 6-30 (БИОЛАМ П-1), КГМ 9-70 (БИОЛАМ И) и КГМ 6-20 (ЕС БИМАМ Р-11, ЕС БИМАМ Р-13, ЕС БИМАМ Р-31). При повседневной работе целесообразно пропускать искусственный свет через матовый светофильтр конденсора.

В настоящее время фирмой «ЛОМО» (Санкт-Петербург) выпускаются так называемые микровизоры (рис. 3), то есть микроскопы, у которых вместо оку-ляра присутствует цветной телевизор, что дает, во-первых, возможность оциф-ровывать изображение на компьютере, а во-вторых, просматривать изображение одновременно нескольким лицам.

Рисунок 3. Микровизор

При работе с микроскопами, у которых встроенный источник света отсутствует, рекомендуется использовать следующие приемы в определенной последовательности.

1. Подготовить микроскоп для работы: взять зеркало с плоской поверхностью (вогнутое зеркало применяют очень редко, как правило, при работе с объективами малых увеличений и без конденсора), конденсор поднять в верхнее положение до упора, диафрагму конденсора полностью открыть, поворотом револьвера включить сухой объектив (40х0,65), поставить матовый светофильтр.

2. Исследуемый препарат установить на предметном столике и закрепить специальными клеммами.

3. Повернуть зеркало таким образом, чтобы поле зрения микроскопа было освещено наиболее ярко.

4. Поднимая или опуская тубус макрометрическим винтом, найти плоскость препарата и при необходимости рассмотреть его под малым увеличением.

5. Поворотом револьвера включить иммерсионную систему (объектив 90х1,25) и на препарат нанести каплю иммерсионного масла.

6. Под контролем глаза осторожно погрузить объектив в масло.

7. Проверить освещенность поля зрения и наклоном зеркала улучшить освещенность препарата.

8. Вращением макрометрического винта произвести грубую фокусировку изучаемого препарата.

9. Детали исследуемого объекта рассмотреть, вращая микрометрический винт.

10. Яркость освещения объекта отрегулировать только диафрагмой конденсора (не рекомендуют с этой целью менять положение конденсора). При смене препаратов операции с первой по пятую повторяют.

При работе со специальными осветителями (типа ОИ-32, ОИ-35 и др.) нужно поступать следующим образом.

1. Микроскоп подготовить к работе обычным порядком. Зеркало взять с плоской поверхностью.

2. Осветитель установить перед микроскопом с помощью соединительной планки, прилагаемой к осветителю, или, если ее нет, на расстоянии 20 см от зеркала.

3. Световой поток направить на зеркало, для чего корпус осветителя необходимо наклонить.

4. Закрыв диафрагму осветителя и перемещая патрон лампы вдоль оси, добиться четкого изображения ее нити на закрытой диафрагме конденсора.

5. На предметный столик микроскопа установить и укрепить клеммами препарат.

6. Открыв диафрагмы конденсора и осветителя при малом или среднем увеличении (объективы х8 или х40), найти оптическую плоскость препарата.

7. Закрыв диафрагму осветителя и слегка передвигая зеркало, установить изображение диафрагмы осветителя в центр поля зрения микроскопа.

8. Перемещая конденсор микроскопа по вертикали, получить наиболее четкое изображение границ диафрагмы осветителя. После этого конденсор не подлежит передвижению. Освещение препарата можно уменьшить при помощи диафрагмы конденсора.

9. Под контролем глаза раскрыть диафрагму осветителя, пока свет не зальет почти полностью поле зрения микроскопа. Дальнейшее раскрытие диафрагмы осветителя не улучшает освещения исследуемого объекта.

10. На препарат нанести каплю масла, на тубусе установить иммерсионный объектив, отрегулировать освещение исследуемого объекта и приступить к микроскопии.

Точное исполнение изложенных приемов настройки освещения по Келеру является необходимым условием при специальных исследованиях (микрофотографии, установке фазово-контрастного устройства и т. д.).

Иммерсионный микроскоп содержат в чистоте и предохраняют от механических повреждений. При соблюдении этих требований микроскоп может безотказно работать продолжительное время. После работы с объектива обязательно удаляют иммерсионное масло.

Дополнительные приспособления к биологическому микроскопу

Дополнительные приспособления позволяют максимально использовать все возможности биологического микроскопа, облегчают условия работы и значительно расширяют диапазон его применения. В микробиологии наиболее часто применяются следующие приспособления.

1) темнопольные конденсоры: кардиоид-конденсор и параболоид-конденсор;

2) фазово-контрастные приспособления: КФ-4 и другие модели;

3) бинокулярные насадки: АУ-12 и другие модели, которые приближают микроскопию к условиям естественного зрения. Многие модели микроскопов имеют собственные бинокуляры: БИОЛАМ Р-15, БИОЛАМ Р-17, БИОЛАМ П-1;

4) осветители: ОИ-32, ОИ-35 и другие модели. Источники искусственного света обеспечивают оптимальное и стабильное освещение, интенсивность света в них регулируют реостатом;

5) микрометры: окуляр-микрометр и объект-микрометр, которые используют для измерения микроскопических объектов;

6) нагревательный столик, который устанавливают вместо предметного и таким образом обеспечивают постоянную температуру 37 ⁰С; применяют для длительного наблюдения за живыми микроорганизмами;

7) рисовальный столик, который используют для высококачественной зарисовки препарата; с его помощью можно одновременно видеть изображение объекта и бумаги, расположенной на столе вблизи микроскопа, и обводить на бумаге контуры объекта;

8) оптические светофильтры: цветные и нейтральные; их устанавливают между источником света и микроскопом и применяют при микрофотографии и специальных методах микроскопии;

9) микрофотонасадки: МФН-11, МФН-12 и другие модели, их используют для фотографирования микроскопических объектов;

10) микрокиноустановки, предназначенные для цейтраферной (прерывистой) микросъемки в сочетании с фазово-контрастной микроскопией; они позволяют изучить динамику роста и размножения микроорганизмов, влияние на них разных факторов и многие другие вопросы.

Микроскоп с конденсором темного поля

В микробиологии нашел применение микроскоп с конденсором темного поля. Его используют для повышения контрастности изображения, что имеет боль-шое значение для изучения подвижности бактерий, которые в живом состоянии слабоконтрастны и не видны в обычном микроскопе.

Микроскопия в темном поле основана на явлении дифракции света при силь-ном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля − свечение пылинок в воздухе темного помещения, в которое солнеч-ный луч проникает через небольшую щель).

Для создания темного поля в биологическом микроскопе применяют: щелевой метод, затемнение в объективе, специальные конденсоры − параболоид-конденсор или кардиоид-конденсор, которыми заменяют конденсор в биологическом микроскопе.

Параболоид-конденсор имеет в центре затемнение, задерживающее централь-ные лучи света, и внутреннюю вогнутую зеркальную поверхность для отра-жения краевых лучей. В кардиоид-конденсоре лучи вначале отражаются от выпуклой зеркальной поверхности, затем от вогнутой. Краевые лучи, выхо-дящие из темнопольного конденсора, проходят в косом направлении и не попа-дают в объектив, поэтому поле зрения микроскопа остается темным. В объектив попадают лучи, отраженные от объекта, в связи с чем в поле зрения можно на-блюдать характерное изображение – на темном поле зрения ярко светятся мик-робные клетки и другие частицы, находящиеся в препарате.

В качестве источников света для микроскопа с конденсором темного поля используют сильные осветители (ОИ-32, ОИ-35). Настройку освещения и уста-новку препарата («раздавленная капля») производят, руководствуясь изло-женными выше правилами работы с биологическим микроскопом. Рекомендуется употреблять сухие объективы и предметные стекла толщиной 0,8-1,2 мм. Работа с темнопольным конденсором осуществляется в опреде-ленной последовательности.

1. После настройки освещения и установки препарата обычный конденсор заменяют темнопольным.

2. На верхнюю линзу опущенного конденсора наносят каплю жидкости (кедровое масло, дистиллированную воду), поднимают его вверх до тех пор, пока эта капля не коснется предметного стекла и не распространится по нему.

3. Вращением макрометрического и микрометрического винтов производят фокусировку изучаемого препарата, при этом в поле зрения должно появиться светлое кольцо с темным пятном посредине.

4. Поднимают конденсор до появления светлого пятна (если форма светлого пятна или кольца неправильная, значит капля иммерсионной жидкости мала).

5. Винтами конденсора выводят пятно в центр поля зрения и приступают к исследованию.

При работе с иммерсионными объективами необходимо для уменьшения апертуры объектива внутрь него вложить специальную диафрагму, имеющуюся в наборе конденсора темного поля. При смене объективов конденсор допол-нительно настраивают винтами.

Фазово-контрастный микроскоп

Метод фазового контраста позволяет наблюдать слабоконтрастные биологические объекты (микроорганизмы, растительные клетки) в неокра-шенном состоянии, получая при этом контрастное их изображение. В отличие от микроскопа с конденсором темного поля, выявляющего лишь контуры объекта, метод фазового контраста позволяет увидеть элементы внутренней структуры рассматриваемого прозрачного объекта.

Известно, что качество микроскопии во многом определяется контрастностью объектов, которые в зависимости от светопоглощения подразделяются на ам-плитудные и фазовые.

Амплитудные объекты характеризуются различным светопоглощением, поэтому они изменяют амплитуду (интенсивность) проходящего через них света. К амплитудным объектам относятся все окрашенные препараты, которые изображаются с большим или меньшим контрастом.

Фазовые объекты имеют одинаковое светопоглощение на разных участках, но отличаются оптической плотностью. При прохождении света через такие объек-ты амплитуда его не меняется, а изменяется фаза колебания, что не фиксируется глазом. К фазовым объектам относятся живые неокрашенные микроорганизмы, изображение которых в обычном микроскопе отличается малой контраст-ностью.

Фазово-контрастный микроскоп дает возможность преобразовывать фазовые изменения световых волн, проходящих через объект, в амплитудные, в ре-зультате чего даже прозрачные микроорганизмы становятся видимыми. Прозрачные биологические объекты при фазово-контрастной микроскопии характеризуются достаточно высокой контрастностью – в зависимости от фа-зовой пластинки они могут давать темные изображения на более светлом поле (явление положительного фазового контраста) или же светлые изображения на темном поле (явление отрицательного фазового контраста). Тип прибора обыч-но указан в его паспорте.

Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное приспособление КФ-4, в комплект ко-торого входят следующие предметы:

· объективы с фазовым кольцами, изменяющие фазу и уменьшающие амплитуду световой волны. На их оправе обозначен дополнительный индекс «Ф» − Ф х 10, Ф х 20, Ф х 40, Ф х 90;

· фазовый конденсор с револьвером кольцевых диафрагм для каждого объектива. Индексом «О» обозначено отверстие с ирисовой диафрагмой для наблюдения препарата обычным методом;

· вспомогательный микроскоп малого увеличения, которым заменяют окуляр при наблюдении за настройкой освещения.

При фазово-контрастной микроскопии используют осветители типов ОИ-32 или ОИ-35.

Для исследования методом фазового контраста готовят влажные препараты типа «раздавленная капля». Для этой цели желательно отбирать тонкие стекла. Для длительного наблюдения покровное стекло по краям закрепляют вазелином.

Последовательность работы с фазово-контрастным устройством следующая.

1. Заменяют конденсор микроскопа специальным фазово-контрастным конденсором и устанавливают его таким образом, чтобы при подъеме фрон-тальная линза находилась на уровне предметного столика. Револьвером вклю-чают кольцевую диафрагму «О».

2. Обычные объективы заменяют фазовыми.

3. Помещают препарат на предметный столик микроскопа.

4. Макрометрическим винтом добиваются точной фокусировки на плоскость исследуемого препарата.

5. Устанавливают освещение по правилам Келера, которые изложены выше, после чего в положении осветительной лампы, зеркала и конденсора никаких изменений не допускается.

6. Вместо окуляра вставляют вспомогательный микроскоп. Перемещая окуляр вспомогательного микроскопа внутри тубуса, получают четкое изо-бражение фазового кольца. В этом положении окуляр фиксируют винтом.

7. Вращая револьвер конденсора, включают нужную кольцевую диафрагму, в результате чего в окуляре помимо фазового темно-серого кольца объектива появится изображение светлого кольца диафрагмы конденсора.

8. Вращая центрировочные винты, совмещают светлое кольцо конденсора с темным кольцом объектива.

9. Вспомогательный микроскоп заменяют окуляром.

10. При исследовании объекта используют желто-зеленый светофильтр, который входит в комплект фазово-контрастного устройства.

При правильной установке освещения изображение объектов в препарате должно получиться очень контрастным. При смене объективов или препарата необходимо проверить совмещенность кольцевой диафрагмы конденсора с фазовым кольцом объектива.

Люминесцентный микроскоп

Фотолюминесценцией называют свечение объектов, возникающее в ре-зультате поглощенной ими лучистой энергии. Вследствие некоторых причин свет люминесценции обладает большей длиной волны, чем поглощенный (правило Стокса). Поэтому люминесценцию выгодно возбуждать либо ультрафиолетовыми лучами (30-400 нм), либо сине-фиолетовыми. В обоих случаях возникает люминесценция в цветовой гамме всего или большей части видимого спектра, что дает цветное изображение.

Объект, не дающий явления люминесценции, окрашивают специальными красителями – флюорохромами, после чего нефлюоресцирующие компоненты препарата начинают проявлять явления флюоресценции. Из синтетических флюорохромов наилучшие результаты дают акридин оранжевый, корифосфин, примулин, родамин, ФИТЦ (флюоресцеина изотиоцианат), которые обычно применяют в виде слабых водных растворов. Этот вид люминесценции носит название наведенной, вторичной, в отличие от первичной – собственной флю-оресценции, нередко проявляемой витаминами, многими пигментами, неко-торыми жировыми веществами и антибиотиками, встречающимися в живых организмах, а также некоторыми продуктами нормального и патологического обмена.

Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычными методами обладает рядом преимуществ: цветным изображением, высокой степенью контрастности светящихся объектов на темном поле, возможностью исследования как проз-рачных, так и непрозрачных живых объектов, различных жизненных процессов в динамике их развития, а также возможностью обнаружения и установления локализации отдельных микробов и вирусов.

В настоящее время отечественная промышленность выпускает несколько моделей люминесцентных микроскопов, обеспечивающих исследование объектов путем их освещения в проходящем или отраженном свете в стаци-онарных и полевых условиях: ЛЮМАМ Р-8, МЛД-2, МЛП-01, и ряд моделей для специальных исследований (универсальный исследовательский биоло-гический микроскоп МБИ-15-2). Кроме микроскопа с вмонтированным в него осветителем, работающим на ртутно-кварцевой лампе (ДРШ 250-3, ДРШ 100-2 и другие модели) в комплект прибора входят набор объективов, окуляров и светофильтров, электропульт для питания ртутно-кварцевой лампы, а также специальная переходная втулка фототубуса и втулка фотокамер для установки микрофотонасадки (МФН-11 или МФН-12). Светофильтры, имеющиеся в на-боре микроскопа, предназначены для выделения из общего излучения источ-ника света строго определенных участков спектра.

В микробиологии применяют два метода люминесцентной микроскопии: флуорохромирования и флуоресцирующих антител. Метод флуорохромиро-вания почти не отличается от общеизвестных методов окрашивания анили-новыми красителями, хотя и требует меньше времени (доли минуты). В бак-териологии этот метод применяется для диагностики таких инфекционных форм, как туберкулез, дифтерия, гонорея, возвратный тиф и др. Кроме пере-численных, отечественная промышленность выпускает микроскопы других типов и приспособления к ним. Из них следует назвать ультрафиолетовый, поляризационный, интерференционный, анаптральный и стерескопический микроскопы. Последнее слово микроскопической техники − биологические микроскопы нового поколения единой системы «ЕС» с широкопольной оптикой повышенного контраста изображения со встроенным осветителем (лампа КГМ-6-20) и блоком питания. Эти микроскопы (ЕС БИМАМ Р-11, ЕС БИМАМ Р-13, ЕС БИМАМ Р-31) оснащены бинокуляром, столом с координатным перемещением и предназначены для наблюдения объектов в проходящем свете в светлом поле.

Электронный микроскоп

Электронная микроскопия делает возможным исследование объектов, раз-меры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микро-скопа (0,2 мкм), и находит применение для изучения вирусов, бактериофагов, тонкого строения клеток микроорганизмов и других субмикроскопических объектов, а также макромолекулярных структур.

Приготовление препаратов для исследования микроорганизмов в элект-ронном микроскопе имеет ряд особенностей (максимальная очистка иссле-дуемого материала от примесей; малая толщина биологического объекта, не более 0,1 мкм; препараты готовят на специальных пленках-подложках, так как стекло непроницаемо для электронов; для предохранения объекта от разру-шения потоком электронов препарат исследуют в течение минимального времени).

Различают прямые и косвенные методы приготовления препаратов. При прямых методах исследуемый материал наносят на ультратонкую пленку-подложку, предварительно помещенную на опорную металлическую сеточку, содержащую до 100 ячеек в 1 мм. Используют органические или неоргани-ческие пленки-подложки из коллодия, формвара, углерода, кварца и др. При электронной микроскопии эти пленки не должны обнаруживать собственной структуры и при этом быть достаточно прочными, чтобы выдержать облучение электронами. В биологических исследованиях применяют коллоидные пленки толщиной порядка 10-20 нм.

Широкое распространение получил метод выращивания различных микро-организмов непосредственно на коллодиевых пленках, находящихся на поверх-ности питательной среды, и серийного их исследования в электронном микро-скопе.

При косвенном методе на объект наносят тонкий слой какого-либо вещества (коллодий, кварц, углерод, разнообразные пластмассы) и делают отпечаток-реплику структуры его поверхности. Приготовленный таким образом препарат изучают в электронном микроскопе.

Повышение контрастности изображения объектов достигается несколькими методами.

Метод оттенения

На исследуемый объект наносят тонкий слой металла (хром, золото, уран и др.). Оттенение препаратов проводят на специальных установках вакуумного распыления. При оттенении тяжелыми металлами удается значительно повысить контрастность изображения и получить представление о третьем его измерении.

Метод позитивного контрастирования

Препарат обрабатывают химическими веществами, которые специфически соединяются с определенными структурами объекта. Так, например, уранил-ацетат обнаруживает нуклеиновые кислоты и нуклеопротеиды, осмий – ли-поиды; белки выявляются при обработке солями свинца, фосфорно-молиб-деновой и фосфорно-вольфрамовой кислотами. В результате обработки эти структуры становятся менее проницаемыми для электронов и на экране микро-скопа выглядят темными на светлом фоне поля.

Метод негативного контрастирования

Контрастное вещество (например, фосфорно-вольфрамовая кислота при нейтральном значении рН) при обработке препарата не проникает внутрь, а покрывает его поверхность снаружи. Создается эффект негативного контраста – на темном фоне фосфорно-вольфрамовой кислоты, которая задерживает электронные лучи, выявляются светлые структуры более проницаемого для электронов биологического объекта.

Наиболее полные сведения о внутренней организации микроорганизмов можно получить, применяя метод ультратонких срезов.

Исследуемый объект фиксируют, затем обезвоживают в спиртах восходящей концентрации и заливают в полимеризующиеся пластмассы (например, мета-крилаты). После полимеризации из блоков с помощью специальных ультра-микротомов готовят ультратонкие срезы толщиной 15-30 нм, контрастируют их и исследуют.

Исследование микроорганизмов в окрашенном состоянии

Окрашенные тела микроорганизмов резко отличаются от общего фона препарата, что позволяет установить: а) ориентировочно состав микробного пейзажа изучаемого объекта; б) степень чистоты выделяемой культуры; в) некоторые морфологические особенности микроорганизмов (форму, размеры, наличие спор, жгутиков, капсул).

Приготовление окрашенного препарата состоит из нескольких последо-вательных операций: подготовки мазка, высушивания, фиксации, окраски. Для этого используют совершенно чистые обезжиренные стекла. Наиболее простой способ обезжиривания состоит в натирании предметного стекла кусочком сухого мыла, а затем протирании чистой марлей. Капля воды, нанесенная на хорошо подготовленную поверхность, легко расплывается.

При взятии бактериальной культуры поступают следующим образом:

1) нагревают до покраснения бактериологическую петлю в пламени; петлю держат в правой руке за петледержатель;

2) берут пробирку с культурой в левую руку так, чтобы видеть поверхность питательной среды; вращательным движением вынимают пробку из пробирки, прижимая ее мизинцем и безымянным пальцем правой руки к ладони;

3) обжигают край пробирки, осторожно вводят петлю и берут материал;

4) вынимают петлю, обжигают край пробирки, закрывают ее пробкой

(рис. 4).

Рисунок 4. Техника приготовления мазка

Если препарат готовят из бактериальной культуры, выращенной на плотной питательной среде, то на предметное стекло предварительно наносят каплю стерильного физиологического раствора или стерильной водопроводной воды.

Взятый материал осторожно круговыми движениями распределяют по стеклу ровным тонким слоем, после чего петлю немедленно стерилизуют в пламени. Следует помнить, что в этот период происходит работа с живыми микроор-ганизмами, поэтому резкие движения могут привести к разбрызгиванию мате-риала и повлечь за собой инфицирование рук и окружающих предметов.

Мазки высушивают на воздухе при комнатной температуре или в токе теп-лого воздуха, держа предметное стекло высоко над пламенем. Нельзя допускать перегрева, так как при этом может нарушиться структура микроорганизмов.

При фиксации мазка микроорганизмы погибают и плотно прикрепляются к поверхности стекла, не смываясь при дальнейшей обработке. Наиболее распространенным способом является фиксация в пламени. Предметное стекло (мазком вверх) троекратно проводят через пламя. При таком способе фиксации сохраняются форма бактерий, споры, зерна волютина, однако способ нельзя применять для мазков крови, мазков-отпечатков из органов, а также при выяв-лении спор и жгутиков. Для этих целей проводят фиксацию в этиловом спирте (20 мин.), в жидкости Никифорова, состоящей из смеси равных объемов эти-лового спирта и эфира (20 мин.), в холодном ацетоне.

Существуют простые и сложные методы окраски. При применении простых методов используется только одна краска – водный фуксин (1-2 мин.) или мети-леновый синий (3-5 мин.). По окончании окрашивания препарат промывают струей воды до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной, и сушат его на воздухе при комнатной температуре или осторожно промокая фильтро-вальной бумагой.

Сложные методы окраски предусматривают последовательное использование нескольких красителей различного химического состава, что позволяет выявить определенные структуры бактериальной клетки.

Окраска по Граму

Окраску необходимо проводить в следующей последовательности.

1.Окрасить мазок генцианвиолетом (2 мин., через фильтровальную бумагу).

2.Бумагу удалить, оставшуюся краску слить.

3.Окрасить мазок раствором Люголя (1 мин.).

4.Раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% спирта (30-40 с., осторожно покачивать стекло).

5.Тщательно смыть спирт водой.

6.Окрасить водным фуксином (2 мин.).

7.Промыть водой и высушить.

Все бактерии по отношению к окраске по Граму делятся на грамполо-жительные – темно-фиолетового цвета и грамотрицательные – красного (рис.5). Способность окрашиваться в тот или другой цвет зависит от их химического состава. У грамположительных бактерий в клеточной стенке отсутствуют аро-матические и серосодержащие аминокислоты, отмечается низкое содержание липидов, у грамотрицательных, напротив, эти вещества содержатся в большом количестве. В результате образуется прочный химический комплекс с белком, генцианвиолетом и йодом, который не разрушается при кратковременном действии спирта. У грамотрицательных такой комплекс не образуется. Они легко обесцвечиваются под действием спирта.

Успех окраски зависит от ряда причин и прежде всего от правильности обра-ботки спиртом. При длительном его воздействии краска может быть вымыта и из грамположительных бактерий. В таком случае в ходе дополнительной окрас-ки фуксином они примут красный цвет. Слишком кратковременное действие спирта не позволит выявить грамотрицательные бактерии.

Рисунок 5. Окраска по Граму. Фиолетовые стафилококки и красные вибрионы

Реактивы для окраски по Граму

1. Карболовый генцианвиолет

генцианвиолета 1 г

кислоты карболовой 2 г

спирта 96% 10 мл

воды дистиллированной 100 мл

Растереть в ступке генцианвиолет с карболовой кислотой, добавляя в начале спирт, а потом воду. Раствор выдержать сутки, профильтровать и использовать для окраски.

2. Раствор Люголя

калия йодистого 2 г

йода кристаллического 1 г

воды дистиллированной 300 мл

В небольшом объеме дистиллированной воды растворить йодистый калий, а затем кристаллический йод, после этого довести объем до 300 мл.

3. Спирт 96%

4. Водный фуксин Пфейффера

Приготовление красок

Фуксин готовят в виде концентрированного раствора Циля. Раствор обладает большой стойкостью при хранении. Его применяют при сложных методах окраски (окраска спор, кислотоустойчивых бактерий). Для простого окра-шивания используют фуксин Пфейффера (фуксин Циля, разведенный в 10 раз дистиллированной водой). Он нестоек, и готовят его для работы на один день.

Окраска кислотоустойчивых бактерий

Кислотоустойчивые микроорганизмы обладают выраженной устойчивостью к неорганическим кислотам, спиртам и щелочам. Это связано с наличием в кле-точной стенке и цитоплазме сравнительно большого количества липидов (воскоподобных веществ). Бактерии этой группы очень плохо окрашиваются обычными красками, поэтому применяют концентрированные растворы красок с подогревом. При последующей кратковременной обработке кислотой тела микробных клеток, воспринявшие краску, не обесцвечиваются. Это позволяет отличить кислотоустойчивые бактерии от бактерий, не обладающих этим свойством. Их окрашивают по методу Циля − Нильсена, разработанному с уче-том всех указанных особенностей.

Окраску необходимо проводить в следующей последовательности.

1. Нанести несколько капель карболового фуксина на фиксированный мазок, покрытый фильтровальной бумагой, и подогреть до появления паров (3-5 мин.).

2. Бумагу снять, мазок охладить и обесцветить 5% серной кислотой или 3% солянокислым спиртом (2-4 с.).

3. Тщательно промыть водой.

4. Окрасить леффлеровской синькой (3-5 мин.).

5. Промыть водой и высушить.

Кислотоустойчивые бактерии в результате такой окраски становятся рубиново-красными, а остальные − синими.

Карболовый фуксин Циля

Фуксина основного 1 г

Спирта 96% 10 мл

Кислоты карболовой кристаллической 5 г

Воды дистиллированной 100 мл

Растереть в ступке фуксин с карболовой кислотой, спирт добавлять постепенно, а затем небольшими порциями влить дистиллированную воду.

Метиленовая синь по Леффлеру

Насыщенного спиртового раствора метиленового синего 30 мл

Воды дистиллированной 100 мл

1% водного раствора КОН 1 мл

Окраска спор

Некоторые виды бактерий образуют внутриклеточные (эндогенные) споры. В отличие от вегетативной клетки они обладают меньшим количеством свобод-ной воды, а также высоким содержанием липидов и кальция.

Зрелая спора с трудом поддается окрашиванию из-за малой проницаемости оболочки. При окраске по Граму спорообразующей культуры краска воспри-нимается только вегетативной частью микробной клетки, а спора остается бесцветной. Проницаемость ее оболочки резко увеличивается после обработки горячей соляной кислотой или при использовании концентрированного раст-вора краски с подогревом. Восприняв краску, спора при последующей обработ-ке кислотой не обесцвечивается, в то время как вегетативные клетки немед-ленно отдают краску.

Окраска спор по методу Ожешко

1. Нанести несколько капель 0,5% соляной кислоты на нефиксированный мазок и нагреть до появления паров (2-3 мин).

2. Слить кислоту, промыть водой, высушить.

3. Зафиксировать в пламени.

4. Окрасить по методу Циля − Нильсена. При этом споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы − в синий (рис. 6). Часто для окраски спор используют только метод Циля − Нильсена.

Рисунок 6. Споры возбудителя столбняка, окрашенные в красный цвет

Окраска включений волютина

Волютин - производное нуклеиновой кислоты - играет роль запасного питательного вещества. Среди включений запасного характера − жиры, гли-коген, волютин, который занимает особое место. На основании его присутствия и особого расположения в клетке ставят предварительный диагноз методом бактериоскопии при подозрении на дифтерию. Наиболее демонстративные результаты удается получить при окраске зерен волютина по методу Нейссера.

Методика проведения

1.Окрасить мазок уксуснокислой синькой Нейссера (2-3 мин).

2.Промыть.

3.Окрасить раствором Люголя (30 с).

4.Слить раствор Люголя и окрасить везувином (1 мин).

5. Промыть препарат и высушить.

Цитоплазма клетки, имеющая кислую реакцию, воспринимает щелочной краситель везувин и приобретает желтый цвет. Зерна волютина, прочно фиксировавшие ацетат цинка, − темно-синие, почти черные.

Реактивы для окраски по методу Нейссера

1. Уксуснокислая синька Нейссера

метиленового синего 0,1 г

спирта 96% 2 мл

уксусной кислоты крепкой 5 мл

воды дистиллированной 100 мл

2. Везувин

везувина 2 г

воды дистиллированной 300 мл

Прокипятить приготовленный раствор и, охладив, профильтровать.

Обнаружение капсул у бактерий

Некоторые микробы обладают способностью откладывать на поверхности своего тела мощный слизистый слой вокруг клеточной стенки, его называют капсулой. В состав капсул входят, главным образом, полисахариды, но у некоторых они содержат и полипептиды. Капсулы имеют консистенцию геля, поэтому при микроскопии живых бактерий они видны очень плохо. Для их обнаружения применяют негативную окраску. Все перечисленные методы относятся к позитивным, так как при их использовании окрашиваются микроб-ные клетки. При негативных способах краситель заполняет пространство вокруг бактерий, в результате чего они выглядят светлыми частицами на темном фоне.

Методика обнаружения капсул по методу Бурри

1. Смешать на предметном стекле немного капсульной культуры и каплю разведенной (1:9) туши; приготовить тонкий мазок.

2. Высушить на воздухе и бактериоскопировать. На темном фоне хорошо

видны бесцветные капсулы.

Модификация по Бурри − Гинсу включает создание фона краской конгорот, последующую фиксацию в 5% растворе НСl и дополнительную окраску водным фуксином. В результате общий фон − темного цвета, капсулы − бесцветные, а тела бактерий − красные.

Окраска по Романовскому – Гимзе

Относится к сложным методам и применяется чаще всего для мазков-отпечатков из органов или мазков крови после фиксации в жидком фиксаторе. Позволяет выявить ядерные элементы бактериальных клеток и гранулы волютина. Для окраски берут каплю готовой краски на 1 мл воды, которая должна быть подщелочена до рН 7,2.

Методика проведения

1. Поместить препарат (мазком вниз) в чашку Петри, подложив под края стекла спички или кусочки предметных стекол.

2. Подлить краску сбоку так, чтобы она без пузырей подтекла под мазок (красить 1-24 ч.).

3. Промыть водой (рН 7,2) и высушить.

Протоплазма молодых клеток окрашивается в сине-фиолетовый цвет, ядерные элементы – в красно-фиолетовый.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Какие типы микробиологических лабораторий существуют.

2. Принципы организации микробиологической учебной лаборатории. Оснащение микробиологической лаборатории и рабочего места. Правила работы и техника безопасности.

3. Устройство светового микроскопа. Иммерсионная микроскопия.

4. Темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная и электронная микроскопия и микроскопы (устройства).

5. Приготовление фиксированных препаратов мазков.

6. Простые и сложные методы окраски. Механизм и этапы окраски по Граму. Особенности окраски методами Романовского, Ожешко, Бурри − Гинса, Нейссера, Циля − Нильсена.

7. Приготовление препаратов для изучения микроорганизмов в нативном состоянии. Методы «висячей», «раздавленной» капли. Витальная (прижизненная) окраска.

РАБОТА ПОД РУКОВОДСТВОМ ПРЕПОДАВАТЕЛЯ

1. Ознакомление с основными приборами и оборудованием, используемыми в микробиологических лабораториях.

2. Изучение иммерсионной системы светового микроскопа.

3. Приготовление фиксированных мазков из бактериальных культур и их окраска простыми методами.

4. Микроскопия окрашенных препаратов с использованием обычных и иммерсионных систем.

5. Приготовление фиксированных мазков из бактериальных культур и их окраска сложными методами (по Граму, Цилю – Нильсену, Ожешко, Нейссеру, Бурри – Гинсу).

6. Приготовление препаратов для изучения бактерий в живом состоянии.

7. Приготовление мазков «висячей» и «раздавленной» капли.

8. Приготовление препаратов, окрашенных метиленовым синим.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

1. Записать основные правила работы в микробиологической лаборатории.

2. Приготовить нативные мазки «висячей» и «раздавленной» капли.

3. Приготовить фиксированные препараты из смеси бактериальных культур.

4. Провести микроскопию и зарисовать микроскопические препараты.

ТЕМА № 2. Морфология бактерий. Ультраструктура бактериальной клетки

Знание морфологии и изучение ультраструктуры бактерий является основой микроскопического метода исследования и необходимо для правильного применения химиотерапевтических препаратов.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ

Изучение морфологии и ультраструктуры бактерий.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ

1. Формы бактериальных клеток и методы изучения морфологических особенностей.

2. Основные морфологические особенности бактерий.

3. Основные морфологические типы бактерий.

4. Элементы ультраструктуры бактериальной клетки.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ

1. Дифференцировать бактерии по морфологическим признакам.

2. Определить родовую принадлежность конкретных бактерий по морфологическим признакам.

Морфология бактерий

По форме клеток бактерии делятся на шаровидные, палочковидные и извитые. Шаровидные бактерии (кокки) имеют сферическую форму и по взаимному расположению клеток после деления различаются:

· микрококки- клетки расходятся и располагаются одиночно;

· диплококки- клетки располагаются попарно;

· стрептококки-кокки делятся в одной плоскости и не расходятся после деления;

· тетракокки-деление клеток происходит в двух взаимно перпендикулярных плоскостях и клетки располагаются по четыре;

· сарцины (пакеты)- деление происходит в трёх взаимно перпендикулярных плоскостях;

· скопления кокков, внешне напоминающие виноградную гроздь, называются стафилококками.

Кокки имеют диаметр 1-2 мкм.

Палочковидные бактерии различаются формой клеток, размерами и расположением. Длина их в зависимости от вида микроорганизма колеблется от 0,5 до 8 мкм, а поперечник – от 0,3 до 2 мкм.

Палочки могут быть правильной и неправильной формы, в том числе ветвящиеся, например у актиномицетов.
По характеру расположения клеток в мазках выделяют:

· монобактерии – расположены отдельными клетками;

· диплобактерии – расположены по две клетки;

· стрептобактериии – после деления образуют цепочки клеток.
Палочковидные бактерии могут образовывать споры: бациллы и клостридии.

Извитые формы бактерий представлены изогнутыми палочками и могут иметь один или несколько витков спирали. Слегка изогнутые палочки называются вибрионами. Они имеют длину 1-3 мкм.

Спириллы - длинные, изогнутые (один или несколько завитков).

Спирохеты – длинные, тонкие клетки с большим количеством мелких завитков.

Структура бактериальной клетки

Клетка — универсальная структурная единица живой материи. Организация бактериальной клетки обеспечивает удвоение биомассы за определенный срок за счет размножения посредством бинарного деления.

Элементы ультраструктуры бактериальной клетки

В составе прокариотической клетки выделяют следующие структуры.

1. Клеточная стенка; по химической структуре клеточной стенки различают грамположительные и грамотрицательные бактерии.

2. Периплазматическое пространство.

3. Цитоплазматическая мембрана.

4. Цитоплазма, нуклеоид, мезосомы (аналог митохондрий у эукариотов), рибосомы, включения;

5. У некоторых бактерий – капсула, микрокапсула, жгутики, плазмиды, фимбрии (реснички), споры.

Клеточная стенка — важный и обязательный структурный элемент подавляющего большинства прокариотных клеток. На долю клеточной стенки приходится от 5 до 50% сухих веществ клетки. Клеточная стенка служит механическим барьером между протопластом и внешней средой и придает клеткам определенную, присущую им форму.

Клеточная стенка грамположительных бактерий имеет однородную струк-туру, ковалентно связана с ригидным слоем, содержит небольшие количества липидов, полисахаридов и белков. Она значительно толще, чем у грамотри-цательных бактерий, и достигает 20-60 нм. Основную массу стенки составляют 5-6 слов пептидогликана, с которым ковалентно связаны тейхоевые кислоты. Особенностью пептидогликанов грамположительных бактерий является от-сутствие диаминопимелиновой кислоты.

Толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий составляет 14-18 нм. Ригидный слой представлен 1-2 слоями пептидогликана, в котором есть диаминопимелиновая кислота. В составе клеточной стенки содержится много лиопротеинов, фосфолипидов, липополисахаридов, больше белка, но отсутст-вуют тейхоевые кислоты. Пластичный слой клеточной стенки представлен сложной мозаикой из липопротеинов, липополисахаридов и наружной мембра-ны.

Некоторые бактерии имеют пространство (зону) между клеточной стенкой и плазматической мембраной - периплазматическое пространство ( периплазма ). Толщина периплазмы составляет около 10 нм и может включать до 20% всей находящейся в клетке воды. В ней локализуются некоторые ферменты и транспортные белки - переносчики соответствующих субстратов.

К клеточной оболочке бактериальной клетки тесно прилегает внешний слой цитоплазмы - цитоплазматическая мембрана. Она состоит из двух слоев липидов и встроенных в липидную мембрану белковых молекул. Компоненты цитоплазматической мембраны (ЦПМ) составляют около 10% сухого веса бактериальной клетки. Эта полупроницаемая мембрана контролирует транспорт питательных веществ и воды в клетку, а также является физическим барьером между внутренним содержимым бактериальной клетки и внешней средой.

Содержимое тела бактериальной клетки, или ее цитоплазма, представляет собой желеобразный, вязкий раствор, в котором растворены различные органические и неорганические соединения. Бактериальная цитоплазма неподвижна, имеет высокую плотность, содержит мелкие зерна, состоящие из 60% РНК и 40% протеина, представляющие собой рибонуклеопротеиды, получившие название «рибосом». Они выполняют функцию синтеза белка. Цитоплазма большинства бактерий содержит ДНК и запасные гранулы (крахмала, гликогена, жировых веществ), пигментные скопления, сера, кальций.

Нуклеоид, ядерное вещество клетки, ее наследственный аппарат, состоит из двойной нити ДНК, сомкнутой в кольцо и свободно погруженное в цитоплазму, в отличие от эукариот. В молекуле ДНК закодирована генетическая информация клетки.

Мембранные структуры прокариот менее дифференцированы, чем органоиды эукариот. Бактерии имеют лишь аналоги некоторые из них. Например, аналогом митохондрий у прокариот являются мезосомы, которые образуются путём инвагинации цитоплазматической мембраны и содержат ферменты, необходимые для синтеза АТФ.

У бактерий различают микрокапсулу, капсулу и слизистый слой, которые относятся к факторам патогенности. Микрокапсулы выявляются на электрон-ных микрофотографиях в виде коротких мукополисахаридных фибрилл. Капсула (слизистый слой) играет роль внешнего покрова бактерии, защищает от неблагоприятного воздействия факторов внешней среды и обнаруживается под световым микроскопом после окрашивания по методу Бурри − Гинса.

У некоторых видов микробов имеются пили (реснички, фимбрии, филаменты), представляющие собой образования, которые значительно короче и тоньше жгутиков. Они покрывают тело клетки. Полагают, что они не являются органами передвижения, а способствуют прикреплению микробных клеток к поверхности некоторых субстратов.

Жгутики предназначены для передвижения бактерий. Жгутики построены из специального белка –флагелина. Длина его составляет 20 мкм, диаметр 10-20 нм.

По расположению жгутиков подвижные микробы подразделяются на 4 группы (рис. 7):

· монотрихи — бактерии с одним жгутиком на конце (холерный вибрион);

· амфитрихи — бактерии с двумя полярно расположенными жгутиками или имеющие по пучку жгутиков на обоих концах;

· лофотрихи — бактерии, которые имеют по пучку жгутиков на одном конце (палочки сине-зеленого молока);

· перитрихи — бактерии, обладающие жгутиками по всей поверхности тела (кишечная палочка).

Рисунок 7. Жгутикование бактерий:

A — монотрихиальное, B — лофотрихиальное, C — амфитрихиальное,
D — перитрихиальное.

Исследование микроорганизмов в живом состоянии

В живом состоянии микроорганизмы исследуют с целью выявления их фор-мы, подвижности или определения прижизненной внутренней структуры. Изучают нативные и окрашенные препараты, используя методы «раздавленной» или «висячей» капли.

Прижизненная (витальная) окраска

Взвесь микроорганизмов вносят в каплю 0,001% раствора метиленового си-него или нейтрального красного. Затем готовят препарат «раздавленная» или «висячая» капля и микроскопируют.

Приготовление препарата «раздавленная капля»

На центр обезжиренного предметного стекла наносят каплю жидкой буль-онной культуры. Если культура выращивалась на плотной питательной среде, то на стекло наносят каплю стерильного изотонического раствора натрия хло-рида, затем петлей прикасаются к культуре и приставшие к ней бактерии раз-мешивают в приготовленной капле. Можно заранее приготовить взвесь микро-организмов в изотоническом растворе и взять каплю из нее. На исследуемый материал накладывают покровное стекло так, чтобы не было пузырьков воз-духа. Каплю надо брать такой величины, чтобы она заполняла все простран-ство между покровным и предметным стеклами и не выступала за края по-кровного. Препарат можно рассматривать как с сухими системами, так и с иммерсионной. Микроскопируют, используя объективы 40х или 90х. Очень хорошие результаты получают, применяя темнопольное или фазово-контраст-ное устройства. Препараты быстро высыхают, поэтому, если их приходится рассматривать не тотчас, а спустя некоторое время, их помещают во влажную камеру (чашку Петри), на дно которой положено 2-3 влажных кружка фильтро-вальной бумаги, покрытых двумя сухими.

Во избежание высыхания препарата и вызываемого конвекцией турбулент-ного движения жидкости подобные препараты можно герметизировать. Для этой цели следует пользоваться парафиновым маслом, смесью равных частей парафина и вазелина или лаком для ногтей.

В центре влажного препарата быстро возникает недостаточность кислорода. В сущности именно это помогло Пастеру открыть анаэробный обмен: наблюдая за препаратом, он заметил, что облигатные анаэробы сохраняли подвижность только в центре, но не по краям.

Подвижные микроорганизмы иногда могут адсорбироваться на стекле; в та-ких случаях подвижность легче наблюдать в «висячей» капле.

Приготовление препарата «висячая капля»

Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю бактериальной взвеси. Затем предметное стекло с лункой, края которой пред-варительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки, в результате чего стекла склеиваются. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. Получается герметически закрытая камера, в которой капля долго не высыхает. В правильно приготовленном препарате капля свободно висит над лункой, не касаясь ее дна или края (рис.8). Микроскопируют со стороны покровного стекла, при-чем вначале следует найти край на малом увеличении и при суженной диафраг-ме, используя сухой объектив 8х, затем на большом и продолжить наблюдение.

Рисунок 8. Препарат висячая капля