АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Определение числа клеток высевом на плотные питательные среды (чашечный метод Коха)

В отличие от подсчета клеток под микроскопом, этот метод дает возмож-

ность определить только число жизнеспособных клеток в популяции. Поскольку сред, одинаково пригодных для роста различных микроорганизмов, не существует, метод высева дает возможность определить число клеток микроорганизмов, способных расти на среде данного состава, но не позволяет учесть те микроорганизмы, которые не растутут или растут крайне медленно.

Метод широко применяется для опредления численности жизнеспособных клеток в различных естественных субстратах и в лабораторных питательных средах. Сущность его заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на плотную среду в чашки Петри и подсчете выросших после инкубации колоний. Принято считать, что каждая колония - потомство одной клетки.

Работа этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев на плотную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний.

Приготовление разведений. Численность популяции микроорганизмов обычно достаточно велика, поэтому для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений. Разведения готовят в водопроводной воде или 0,85%-ном растворе NaCl, используя постоянный коэффициент разведения, чаще всего равный 10. В ходе опыта целесообразно использовать один и тот жеикоэффициент разведения, так как это уменьшает вероятность ошибки. Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разливают по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл иссле-дуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 мл стерильной воды — это 1-е разведение,10^-1. Полученное разведение тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, вбирая в пипет­ку и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру выполняют 3—5 раз, затем этой же пипеткой отбирают 1 мл полученной суспензии и переносят во 2-ю пробирку — получают 2-е разведение, 10^-2. Таким же образом готовят и последующие разведения. Степень разведения зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов; соот­ветственно она тем больше, чем больше плотность популяции.

Для приготовления каждого разведения следует обязательно ис­пользовать новую пипетку. Пренебрежение этим правилом приводит к получению ошибочного результата.

Проведение посева. Высевать суспензию можно поверхност­ным или глубинным способом.

Перед посевом поверхностным способом (рис. 16) разливают рас­плавлен-ную, чаще всего агаризованную, питательную среду в ряд сте­рильных чашек Петри по 15—20 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверх-ности, поеа среда не застынет. Поверхность агаризованных сред перед посевом рекомендуется подсушивать для удаления конденсационной воды. С этой целью чашки Петри открывают и застывшей средой вниз помещают на 20-30 мин в сушильный шкаф, нагретый до 70-80⁰ С. Предварительно шкаф необходимо простерилизовать.

Рисунок 16. Схема приготовления разведений и рассева суспензии микроорганизмов шпателем.

Агаризованную среду можно подсушить, поместив чашки в тер­мостат на 2—3 суток крышками вниз. После того как среда готова, на ее поверхность стерильной пипеткой наносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 мл) соответствующего разведения и распределяют его стерильным стеклянным шпателем по поверхности среды. Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех последних разведений, причем из каждого делают 2—4 параллельных высева. Посевы можно делать одной пипеткой, но при этом начинать следует обязательно с большего разведения. Для каждого разведения используют новый сте­рильный шпатель. После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз.

При глубинном посеве (рис. 17) точно измеренный объем (как правило, 0,1, 0,5 или 1 мл) суспензии или разведения вносят в расплав­ленную и остуженную до 48—50° агаризованную среду, тщательно пе­ремешивают и затем немедленно выливают в чашку Петри. Среде дают застыть. В случае глубинного посева обычно пользуются средой, раз­литой в пробирки. При больших масштабах работы среду по пробир­кам не разливают, а поступают следующим образом. По

Рисунок 17. Схема приготовления разведений и посева суспензии микроорганизмов глубинным способом

1 мл из соот­ветствующего разведения переносят стерильной пипеткой в 2—4 сте­рильные чашки Петри. Затем заливают чашки 15—20 мл расплавлен­ной и остуженной до 48—50° плотной средой и тщательно смешивают питательную среду с посевным материалом легким вращательным движением чашки по поверхности стола, после чего чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания. Когда среда застынет чашки Петри помещают в термостат.

Для определения количества клеток анаэробных микроорганизмов чашки Петри с плотной средой после посева помещают в анаэростаты.

Подсчет выросших колоний. Колонии бактерий подсчиты­вают обычно через 3, колонии грибов и дрожжей — через 5—7, а колонии актиномицетов — через 7—15 суток инкубации в термостате.

Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства чернилами или карандашом по стеклу отмечают просчитан­ную колонию точкой на наружной стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри делят на секторы, подсчитывают число колоний в каждом секторе и результаты суммируют. Существуют специальные счётчики для подсчёта колоний (рис.18). Для подсчёта колоний чашкуПетри крышкой вниз помещают на стерильный столик (1), подсвечиваемый снизу, и подсчитывают колонии пером с пружинным острием (2). Остриём пера касаются дна чашки в участке, соответствующем положению колоний, и нажимают на перо. В результате на стекле остается метка, а держатель поднимается вверх, замыкая цепь, и показания счётчика увеличиваются на единицу. Затем острие пера поднимают над стеклом, пружина возвращает его в исходное положение, и цепь размыкается.

Рисунок18. Счетчик для подсчета числа колоний микроорганизмов