АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Образование антибиотических веществ

В процессе жизнедеятельности многие микроорганизмы образуют специ-фические продукты, которые обладают высокой физиологической активностью по отношению к другим микрорганизмам и вирусам, задерживая их рост или убивая их. Они называются антибиотиками. В промышленных масштабах антибиотики получают путём биосинтеза микроорганизмами-продуцентами и полусинтетически, трансформируя химическим путем молекулы природных антибиотиков. Знание химического строения природных антибиотиков позволяет получать некоторые из них, например левомицетин, путем химического синтеза. Антибиотики обладают способностью убивать или тормозить рост и развитие микроорганизмов. В связи с этим различают бактериостатическое и бактерицидное действие антибиотиков. В отношении противогрибковых антибиотиков говорят о их фунгистатической и фунгицидной активности.

Многими исследователями показана эффективность примене­ния антибиотиков для задержки микробной порчи скоропортя­щихся пищевых продуктов, особенно в сочетании с холодом.

Разрешается использование лишь некоторых антибиотиков (нистатина и биомицина) и только в ограниченных случаях (например, при транспортировании на дальние расстояния) для сырых продуктов (мясо, рыба), которые в последующем сохра­няются на холоде. Допустимое содержание антибиотиков в про­дукте строго регламентируется, и требуется полное разрушение его в процессе обычной тепловой кулинарной обработки.

Для количественного выражения биологической активности вещества введено понятие единицы действия (ЕD). За единицу действия антибиотика принимают минимальное количество вещества, которое задерживает рост и стандартного штамма микроорганизма в строго определенных условиях. Для большинства антибиотиков 1 ЕD соответствует 1 мкг химически чистого препарата.

Современные методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам делят на методы серийных разведений и диффузионные методы.

Методы серийных разведений основаны на определении основного коли-чественного показателя, характеризующего микробиологическую активность антибиотика − величины его минимальной подавляющей концентрации (МПК), то есть минимальной концентрации, подавляющей рост исследуемого микро-организма. Для этого заданные концентрации антибиотика вносят в питатель-ную среду, которую затем засевают культурой исследуемого микроорганизма, и после инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста.

В зависимости от характера используемой питательной среды различают методы серийных разведений в агаре или в бульоне. В зависимости от объема используемой жидкой питательной среды выделяют методы серийных макро- и микроразведений.

Диффузионные методы определения чувствительности основаны на диф-фузии антибиотика в плотной питательной среде и подавлении роста ис-следуемой культуры в той зоне, где концентрация антибиотика превосходит МПК.

В диско-диффузионном методе в качестве носителя антибиотика используют бумажный диск. Образование зоны подавления роста происходит в результате диффузии антибиотика из носителя в питательную среду. Величина диаметра зоны подавления роста обратно пропорциональна МПК.

Для оценки чувствительности необходимо использовать только специально предназначенные для этой цели среды (Мюллера − Хинтона, АГВ и др.).

Вид питательной среды для оценки чувствительности определяется выбран-ным методом проведения исследования (агар или бульон), а также видом тес-тируемого микроорганизма. Выбранная питательная среда для определения чув-ствительности готовится из сухой среды промышленного производства в со-ответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования питательную среду сразу же разливают в стерильные пробирки или в чашки Петри, или (если необходимо) колбы со средой помещают на водяную баню при 48–50⁰С, где вы-держивают до достижения указанной температуры, после чего в них асепти-чески вносят термолабильные питательные добавки и/или рабочие растворы антибиотиков, а затем разливают в пробирки или в чашки Петри.

Агар разливается по чашкам слоем 4 мм (на чашку диаметром 100 мм требуется 25 мл агара, на чашку диаметром 90 мм − 20 мл). Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Приготовленные указанным обра-зом чашки Петри предпочтительнее использовать немедленно. Допускается хра-нение в запаянных полиэтиленовых пакетах в холодильнике при 4-8 ⁰С в тече-ние недели.

Приготовление суспензии (инокулюма) исследуемой культуры

Концентрация бактерий должна составлять 1,5´10⁸ КОЕ/мл. Оптическая плотность бактериальной суспензии с данной концентрацией соответствует стандарту мутности 0,5 по Мак-Фарланду. Существуют коммерчески доступные стандарты мутности и спектрофотометры.

Приготовление суспензии из агаровой культуры

Отбирают несколько однотипных, четко изолированных колоний, выросших на неселективных плотных питательных средах. Петлей переносят незначи-тельное количество материала с верхушек колоний в пробирку со стерильным физиологическим раствором или питательным бульоном, доводя плотность до 0,5 по стандарту Мак-Фарланда. Приготовленную суспензию следует исполь-зовать в течение 15 мин. после приготовления.

Приготовление суспензии из бульонной культуры

Можно использовать 5-6-часовую бульонную культуру микроорганизма. Для этого отбирают несколько однотипных изолированных колоний, петлей переносят незначительное количество материала в пробирку с 5,0 мл жидкой неселективной питательной среды. Инкубируют при 35 ⁰С. Примерно через 5-6 ч. инкубации плотность микробной суспензии приблизительно соответствует необходимой, и ее точно доводят до 0,5 по Мак-Фарланду путем добавления стерильного бульона или физиологического раствора.

Диско-диффузионный метод

Метод основан на способности антибиотика диффундировать из пропитан-ных ими бумажных дисков в питательную среду, угнетая рост микроорганиз-мов, посеянных на поверхности агара.

Плотную питательную среду готовят в соответствии с инструкцией изго-товителя. Перед заполнением расплавленной средой чашки Петри устанав-ливают на строго горизонтальную поверхность (выверенную по уровню, без впадин и выпуклостей). Соблюдение указанных предосторожностей необхо-димо в связи с тем, что размер и форма зоны ингибиции роста зависят от глу-бины и равномерности агарового слоя.

При использовании свежеприготовленных чашек или чашек после хранения в холодильнике их необходимо подсушить перед инокуляцией, что достигается инкубацией при 35 ⁰С с приоткрытой крышкой в течение 10-20 мин. Перед инокуляцией необходимо проконтролировать отсутствие конденсата жидкости на внутренней поверхности крышек.

Для определения чувствительности следует использовать только стандарти-зированные качественные диски. При определении чувствительности диско-диффузионным методом используют стандартный инокулюм, соответствующий по плотности 0,5 по стандарту Мак-Фарланда и содержащий примерно 1,5х10⁸ КОЕ/мл. Инокулюм следует использовать в течение 15 мин. после приготовления. Стандартный инокулюм наносят пипеткой на поверхность чашки Петри с питательной средой в объеме 1-2 мл, равномерно распределяют по поверхности покачиванием, после чего удаляют избыток инокулюма пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 10-15 мин.

Не позднее, чем через 15 мин. после инокуляции на поверхность питательной среды наносят диски с антибиотиками. Аппликацию дисков проводят с помощью стерильного пинцета или автоматического диспенсера. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно быть 15-20 мм. Таким образом, на одну чашку диаметром 100 мм следует помещать не более 6 дисков с антиби-отиком. Диски должны равномерно контактировать с поверхностью агара, для чего их следует аккуратно прижать пинцетом.

Непосредственно после аппликации дисков чашки Петри помещают в термостат кверху дном и инкубируют при температуре 35^оС в течение 18-24 ч. (в зависимости от вида тестируемого микроорганизма).

После окончания инкубации чашки помещают кверху дном на темную ма-товую поверхность так, чтобы свет падал на них под углом в 45⁰ (учет в отра-женном свете). Диаметр зон задержки роста измеряют с точностью до 1 мм (рис.14).

Рисунок 14. Диско-диффузионный метод

При измерении зон задержки роста следует ориентироваться на зону полного подавления видимого роста. Крупные колонии, выявляемые в пределах четкой зоны подавления роста, свидетельствуют о наличии посторонней микрофлоры.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 686 | Нарушение авторских прав