АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Молекулярно-генетические методы

ДНК- гибридизация. Различают две методики гибридизации:

1. Гибридизация, проводимая в растворе.

2.Гибридизация, проводимая на твердой поверхности (блот-гибридизация).

Гибридизация в растворе. При реализации этого метода искомая нуклеиновая кислота и зонд взаимодействуют в водной реакционной смеси, что повышает скорость процесса гибридизации.

Метод ДНК-гибридизации основан на способности денатурированной одно-цепочечной ДНК достраивать гомологичную цепь в бесклеточной системе. В качестве материала для второй цепи используют ДНК зонды (коммерческие фрагменты молекулы известной ДНК, гомологичные фрагментам искомой ДНК возбудителя меченные радиоактивным изотопом или ферментом).При наличии в исследуемом материале гомологичных участков ДНК, по закону комплементарности, ДНК-зонд взаимодействует с ним. Учет результата проводят по уровню радиоактивности или при добавлении к пробе субстрата, который соответствует используемому в зонде ферменту. Образование специфического комплекса субстрат-фермент означает, что в исследуемом материале есть ДНК соответствующая ДНК - зонду.

Гибридизация на твердом носителе (блот-гибридизация). Основана на ДНК - гибридизации зонда на твердой поверхности, которой является полимерный мембранный фильтр. Основные этапы исследования:

- исследуемый образец обрабатывают ультразвуком для получения коротких фрагментов, находящихся в нем ДНК;

- проводят денатурацию нуклеиновой кислоты (НК);

- денатурированные НК наносят на мембранный фильтр и фиксируют;

- предварительную гибридизацию проводят со специальным буфером при 65⁰С в течение 4 часов;

- добавляют гибридизационный буфер, который содержит денатурированный зонд и проводят гибридизацию при 65⁰С в течение 16 часов.

«Сэндвич» - гибридизация. Этот метод предполагает использование двух видов ДНК- зондов, которые гомологичны различным участкам искомой нуклеиновой кислоты. Чтобы связать искомую нуклеиновую кислоту, присутствующую в исследуемом образце, один зонд фиксируют на мембране. После окончания процесса гибридизации мембрану отмывают от исследуемого материала и добавляют раствор, который содержит второй зонд, несущий метку. После этого процесс гибридизации повторяют, при этом меченный зонд взаимодействует с искомым участком нуклеиновой кислоты. Окончательная детекция проводится в зависимости от характера метки: ферментно-гибридизационные, флюоресцентные, хемилюминесцентные и т.д.

Гибридизация in situ. Процесс гибридизации проводят непосредственно на срезе или в мазке с использованием зондов. Основу метода составляет принцип твердофазной гибридизации или гибридизации в растворе. Зонд, который используется в реакции, содержит флюоресцирующую метку. После окончания процесса гибридизации связавшиеся молекулы в исследуемом мазке или срезе выявляют в флюоресцентном микроскопе. Метод позволяет проводить количественный анализ.

Полимеразная цепная реакция. Принцип метода основан на естественной репликации ДНК, которая включает денатурацию спирали ДНК, расхождение нитей и комплементарный с интез новых нитей ДНК. ПЦР обеспечивает амплификацию фрагментов генома и быстрое накопление определенной последовательности ДНК. В результате получают большое количество ДНК, которое достаточно для проведения анализа различными методами детекции. Для реализации реакции используют набор праймеров-фрагментов ДНК, которые являются маркерами данного возбудителя. При добавлении такого праймера к пробе исследуемого материала, содержащей денатурированную одноцепочечную ДНК возбудителя, происходит их соединение с комплементарным участком ДНК. Образовавшиеся двунитевые фрагменты ДНК служат матрицей для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации и так повторяется много раз, поэтому реакция носит цепной характер. За 2 - 3 часа происходит 30 -40 циклов амплификации, что приводит к образованию большого количества соответствующих копий нуклеотидных последовательностей, которое можно зарегистрировать.

Компоненты реакции:

1. Праймеры-олигонуклеотиды, которые состоят из 15-30 нуклеотидов, комплиментарных участкам на идентифицируемой матричной ДНК.

2. Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов, которые являются строительным материалом, используемым Tag - полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

3. Tag -полимераза обладает ДНК - полимеразной активностью.

4. Буферный раствор, катализатор фермента Tag - ДНК- полимеразы.

5. Исследуемый образец-препарат, который служит мишенью для последующей амплификации.

ДНК-чипы. Технология ДНК чипов основана на гибридизации нуклеотидной последовательности исследуемого материала с известными ДНК последовательностями, расположенными в определенном порядке, иммобилизованными на поверхности стекла или кремня. Результат реакции детектируется по флюоресценции зонда, предварительно меченного флюорохромом и гибридизированного с одной из иммобилизированных проб

Биочип - матрица, состоит из ячеек. В каждой ячейке закреплен олигонуклеотид 9последовательность из нескольких нуклеиновых кислот). Каждый нуклеотид имеет одинаковую длину и отличается от другого последовательностью аминокислот.

Исследуемый образец наносят на все ячейки чипа, а затем через некоторое время сливают. Если имеется нуклеотид комплементарный закрепленному в ячейке, то между ними образуется связь и после промывания они не удаляются. Затем образец помещают в флюоресцентный микроскоп, который регистрирует результат образования комплекса по световому сигналу. Светящиеся ячейки кодируют олигонуклеотиды исходной пробы. Таким образом, зная нуклеотиды, которые были изначально помещены в данной ячейке, можно сделать вывод о составе фрагмента исследуемой ДНК.

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 902 | Нарушение авторских прав