Таблица 11.1. Известные сайты узнавания для рестриктаз в последовательности плазмиды pOV230, несущей встроенную овальбуминовую кДНК (остатки 13-1872 на рис. 11.18)
Фермент1)
Номера остатков2)
Узнаваемые последовательности
1) Отсутствуют сайты узнавания для рестриктаз Hae II, Hind II, Hind III, Hha I, Hpa II, E coRI, Ava I, Bam I, Bal I, Bgl II, Sma I, Xho Iи SalI.
21 Приведены номера, соответствующие положению первого (5'-) нуклеотида в узнаваемой последовательности, а не точке расщепления. Для случаев, когда расщепление происходит внутри узнаваемой последовательности, положение соответствующей точки помечено косой чертой. (По Me Reynolds L. et. al. 1978. Nature, 273, 723.)
мРНК состоит из 1872 нуклеотидов, что значительно больше, чем необходимо для кодирования аминокислотной последовательности овальбумина. Овальбуминовая мРНК содержит транслируемый участок из 1158 нуклеотидов, заключенный между нетранслируемыми фланкирующими 5'- и 3'-участками, а также некодирующий «хвост» poly А на 3'-конце. Двухспиральная ДНК-копия (кДНК) молекулы мРНК синтезируется in vitro с помощью обратной транскриптазы и после встраивания в подходящий плазмидный вектор клонируется в E. coli. Полученная таким образом рекомбинантная плазмида pOV230 содержала в качестве вставки к ДНК, соответствующую остаткам 13-1872 исходной мРНК. Была определена нуклеотидная последовательность кДНКфрагмента гибридной плазмиды и составлена карта расположения на ней сайтов узнавания ферментами рестрикции. Соответствующая последовательность мРНК, выведенная из последовательности кДНК, показана на рис. 11.18, а список сайтов расщепления кДНК рестриктазами приведен в таблице 11.1. Здесь существенно отметить, что в овальбуминовой кДНК отсутствуют сайты узнавания для рестриктаз Eco RI и Hind IIIи имеется один сайт расщепления Нае IIIпо остатку 818. После расщепления очищенной плазмиды pOV230 рестриктазами HindIII и Нае IIIкДНК можно отделить от плазмидной ДНК в виде