АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Выделение лимфоцитов на градиенте плотности

Для выделения лимфоцитов из крови крупного рогатого скота используется ряд методов, позволяющих получить относительно чис­тую суспензию лимфоцитов. Наибольшее количество этих клеток вы­деляется при центрифугировании в градиенте плотности урографина или смеси фиколл-урографина плотностью 1,077 г/см3.

Из 76%- или 60%-ного урографина с помощью дистиллированной воды получают 17%-ный раствор, доводя плотность до 1,092 г/см3. В теплой дистиллированной воде готовят 9%-ный раствор фиколла-400 и 34%-ный раствор урографина. Затем смешивают их в соотношении 12:5 соответственно и доводят плотность до 1,077 г/см3.

В пробирки Флоринского с помощью шприца с длинной иглой вносят по 2 мл 17%-ного раствора урографина или смесь фиколлурографина, на который наслаивают по 4 мл смеси равных объемов крови и раствора Версена, а затем центрифугируют по 20-30 минут при 420 g, если кровь от взрослых животных, или при 600 g, если кровь от молодых животных. После центрифугирования лимфоциты концентрируются в виде матового диска на границе двух жидкостей, а гранулоциты и эритроциты оседают на дно пробирки. Образовав­шийся слой лимфоцитов извлекают шприцем с длинной иглой и от­мывают от примесей центрифугированием в пробирках Флоринского по 5 минут при 210 g, используя дважды по 3 мл раствора Версейа, а затем такое же количество раствора Хенкса, в 1 мл которого готовят взвеси выделенных клеток с концентрацией 2-3 тыс./мкл лимфоцитов для последующих постановок реакций розеткообразования. Для под­счета разведения лимфоцитов в 0,38 мл 3%-ной уксусной кислоты вносится 0,02 мл взвеси лимфоцитов. Подсчитывают в камере Горяева в 5 больших квадратах, разделенных на 4, по диагонали. Получен­ную сумму делим на 8. Результат равен количеству мл раствора Хенкса, необходимого для разведения осадка лимфоцитов, чтобы полу­чить концентрацию 2-3 тыс/мкл. Данный коэффициент выведен из расчета, что при концентрации 2-3 тыс/мкл в среднем должно со­держаться 8 клеток в одном большом квадрате.

Дата добавления: 2014-12-12 | Просмотры: 1620 | Нарушение авторских прав