АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Практическая работа. 1. Изучить классификацию и характеристику основных гуморальных факторов неспецифической резистентности (записать в тетрадь)

1. Изучить классификацию и характеристику основных гуморальных факторов неспецифической резистентности (записать в тетрадь)

2. Изучить действие желудочного сока на бактерии (записать в тетрадь, оформить протокол)

В опыт берут две пробирки (стерильные): опытную и контроль­ную. В опытную пробирку наливают 0,5 мл желудочного сока, аконтрольную – 0,5 мл физиологического раствора. Затем в обе пробирки наливают по 0,5 мл взвеси бактерий водного вибриона (стандарт 500 млн./мл). Содержимое пробирок перемешивают, ставят в термостат для инкубирования нa 30 мин при температуре 37°С, после чего производят высев из контрольной и опытной пробирок на чашки с МПА. Чашки помещают в термостат на 24 часа при 37°С, после чего учитывают результат. При учете результатов обращают внимание на отсутствие или слабый рост бактерий, обработанных желудочном соком ипышный рост бактерий при высеве из контрольной пробирки.

3. Изучить действие лизоцима на М. luteus (M.lysodeiсticus) (записать в тетрадь, оформить протокол)

Из яичного белка приготовлены разведения 1:25, 1:50, 1:100, 1:200 и разлиты по 0,5мл в стерильные пробирки, пятая пробирка служит контролем, в нее налито 0,5 мл физиологического раствора. Затем в каждую пробирку долито по 0,5 мл взвеси культуры микрококка (стандарт 1 млрд./мл), пробирки ставят в термостат для инкубирования на 1 час. После чего пробирки рассматривают и отмечают степень растворения микробов плюсами по четырехбальной системе:

(++++) – полное растворение бактерий, жидкость прозрачная

(+++) – незначительный осадок или легкая опалесценция

(++) – осадок более выражен, растворено примерно 50% клеток

(+) – значительный осадок, растворено примерно 25% клеток

(-) – значительный осадок, жидкость такой же мутности, как в контроле

Результаты опыта рассчитайте по данным таблицы 3:

Таблица 3

Вывод: титр лизоцима яичного белка.........

4. Изучить опреде­ление уровня лизоцима методом диффузии в агаре (записать в тетрадь, оформить протокол)

Лизоцим - один из неспецифических факторов защиты орга­низма от ряда патогенных бактерий и даже вирусов. Нахо­дится в различных биологических жидкостях и тканях: слез­ной, слизистых дыхательных путей и кишечника, в коже, мо­локе, почках, семенной жидкости, сыворотке крови и др.

Лизоцим вызывает повреждение мембран бактерий с их последующей гибелью как самостоятельно, так и при взаимодействии с IgA. Определение активности лизоцима имеет значение для оценки тяжести протекания инфекцион­ных заболеваний, изучения динамики лечения. Позволяет объективно оценить степень нарушения периферического звена иммунной системы.

Принцип метода. Для определения уровня лизоцима используется метод диффузии в агаре. Измеряется зона лизи­са клеток и определяется концентрация лизоцима в иссле­дуемых образцах относительно контрольных разведений ли­зоцима.

Техника постановки анализа:

1. В застывшем агаре пробочным сверлом сделать 5 лунок диаметром 8 мм: 3 лунки для контрольных растворов ли­зоцима; 2 лунки для исследуемых образцов;

2. В каждую лунку закапать по 0,15 мл контрольных и ис­следуемых образцов;

3. Инкубировать чашку 18–20 ч при t = 37°С

После инкубации вокруг лунок образуются зоны ли­зиса.

Учет результатов. Измерить зоны лизиса вокруг лу­нок и определить концентрацию лизоцима в исследуемых растворах с помощью калибровочной кривой. Калибровоч­ную кривую строят при помощи контрольных разведений лизоцима. По оси абсцисс откладывается величина зон лизи­са, по оси ординат – концентрации контрольных растворов лизоцима.

Контроль качества. На предварительно построенной карте Шухарта обозначить значения контрольных величин при каждой постановке анализа.

5. Изучить пути активации комплемента по схеме (зарисовать)

6. Изучить метод определения общей гемолитической ак­тивности комплемента по 50% гемолиза (записать в тетрадь оформить протокол)

Определение комплемента в исследуемой сыворотке основано на его способности, вызывать гемолиз сенсибилизированных эритроцитов (реакция иммунного гемолиза). Активность комплемента выражается в гемолитических единицах. За одну гемолитическую единицу комплемента принимают такое его количество, которое вызывает гемолиз 50% 0,5 мл стандартной взвеси сенсибилизированных эритроцитов при 37°С за 45 мин. Эта единица условная, она зависит от концентрации бараньих эритроцитов, количества антител, ионной силы системы.

Для постановки опыта готовят буферный раствор, разводят исследуемую сыворотку, разливают ее в две пробирки по 0,1 и 0,25 мл, туда же доливают буферный раствор, доводя объем до 1,5 мл. В каждую пробирку вносят по 1,5 мл гемолитической системы, состоящей из равного объема гемолитической системы, состоящей из равного объема гемолитической сыворотки и 3% взвеси бараньих эритроцитов. Пробирки встряхивают и инкубируют 45 мин при 37°С, затем охлаждают в рефрижераторе при 2–4°С 18–19 часов. На следующий день проводят фотометрирование надосадочной жидкости из каждой пробирки и по калибровочной кривой определяют гемолитическую единицу комплемента. Калибровочную кривую строят по гемолизу стандартной взвеси эритроцитов. В сыворотке здоровых людей содержится 40–80 гемолитических единиц комплемента. Уровень комплемента у женщин ниже, чем у мужчин.

Существуют два пути оценки активности комплементов: 1) определение общей гемолитической активности по титру (50 или 100% гемолиз); 2) для более полной характеристики выраженности активации комплемента – определение от­дельных компонентов комплемента (СЗ, С4, С5 и др.) мето­дом РИД, ИФА, турбодиметрии.

Принцип метода. Общая активность комплемента определяется в гемолитической системе, которую использу­ют для реакции связывания комплемента (эритроциты бара­на + специфическая ан-тисыворотка). При взаимодействии сыворотки, содержащей комп-лемент, с антикомплементар­ной сывороткой происходит гемолиз эритроцитов. Гемоли­тическая активность комплемента устанавливается по мини­мальному количеству свежей сыворотки, необходимой для лизиса 50% эритроцитов, содержащихся в 1 мл стандартизо­ванной гемолитической системы при 37°С за 1 час. Акти-вность комплемента выражается в 50% гемолитических единицах – СН50. У здорового человека система неактивна и уровень комплемента сыворотки равен 40–80 СН50. Активация ком­племента приводит к усилению фагоцитоза иммунных ком­плексов и бактерий; увеличению выхода ферментов из лизосом; стимуляции гистаминообразования с повышением про­ницаемости капилляров; усилению хемотаксиса; лизису кле­ток, на которых фиксирован комплемент и т.д. В активации комплемента участвуют ионы кальция и магния.

Техника постановки анализа:

- исследуемую сыворотку развести ВМБ 1:10 (0,5 мл + 4,5 мл);

- разлить в 10 пробирок в объеме от 0,05 до 0.5 мл с разни­цей между отдельными пробирками в 0,05 мл;

- сыворотку довести буферным раствором до объема 1,0 мл, затем в каждую пробирку добавить по 1,0 мл раствора стандартной гемолитической системы;

- пробирки встряхнуть и инкубировать 60 мин. в термоста­те при t = 37° С, затем охладить 10 мин. в холодильнике при t = +2 – +4°С и центрифугировать 10 мин. при 1500–2000 об/мин.;

- одновременно поставить контроль по отсутствию гемоли­за (1,0 мл раствора сенсибилизированных эритроцитов и 1,0 мл ВМБ).

Учет результатов. Степень гемолиза определяется на ФЭК (при длине волны 400°480 нм) в кювете толщиной 5 мм, или на спектрофотометре (541 нм). Процент гемолиза можно высчитать по числовым значениям экстинции по формуле:

% гемолиза = ЕОП х 100,

ЕК

где ЕОП – показатель экстинции опыта, ЕК – показатель экс­тинции контроля (100% гемолиз). За единицу гемолитической активности комплемента (СН50) принимают его количество, способствующее 50% ли­зису 0,5 мл сенсибилизированных эритроцитов. Для расчета 50% гемолитических единиц комплемента в 1 мл исследуе­мой сыворотки (X) используется формула: Х= 1/V₁ где V₁ – объем сыворотки (1:10), соответствующей 1 СН50.

Процент гемолиза можно расчитать также с помощью калибровочной кривой. Для каждого ФЭК необходимо по­строить свою калибровочную кривую и использовать ее при последующих титрованиях комплемента.

Для приготовления шкалы гемолиза необходимо при­готовить 4 мл стандартизированной 5% взвеси эритроцитов. Смешать этот раствор с 12 мл дистиллированной Н₂О. В ре­зультате лизиса эритроцитов, весь содержащийся в них гемо­глобин выходит в раствор (100% гемолиз). Из полученного раствора гемоглобина готовится шкала гемолиза (табл.4). Полученные разведения измеряются на ФЭК при дли­не волны 400–480 нм в кювете с толщиной слоя 0,5 см и строится график зависимости показателя оптической плотно­сти от «процента гемолиза». На оси абсцесс откладывается процент гемолиза, на оси ординат – показатель оптической плотности, соответствующий данному проценту гемолиза.

Таблица 4

Дата добавления: 2015-10-11 | Просмотры: 945 | Нарушение авторских прав