Нормативные критерии фагоцитоза
Показатель
| Фагоцитоз
| Staphylococcus
| C.albicans
| Фагоцитарный индекс (%)
| 40–50
| 40–80
| Фагоцитарное число (количество клеток на один нейтрофил)
|
4–9
|
1–2,5
|
Методика постановки и учета ОФИ при заболеваниях различна (визуальная, культуральная, изотопная). При визуальном варианте в пробирку с 0,25 мл 2% раствора цитрата натрия добавляют 0,5 мл крови больного и 0,2 мл специального антигена (культура возбудителя заболевания в определенном объеме) для опсонофагоцитарной реакции (ОФР). Содержимое пробирок перемешивают и 30 минут инкубируют в термостате при 37°С, затем готовят из каждой пробы мазки, фиксируют их и окрашивают метиленовой синькой. Учет результатов производят путем подсчета количества фагоцитированных одним фагоцитом бактерий в учтенных подряд 100 фагоцитах. ОФИ должен быть больше единицы. В клинической практике ОФИ определяют при бруцеллезе, коклюше, дифтерии, риккетсиозах.
5. Ознакомиться с принципом метода хемилюминесценции (записать в тетрадь)
В активированном нейтрофиле (процесс переваривания антигена) происходят мощные метаболические изменения, сопровождающиеся усилением химической активности, окислением мембранных компонентов; выделением энергии, хемилюминесценцией – «метаболический взрыв». Люминол, окисляющийся под влиянием кислородных метаболитов, генерирует квант света, который регистрируется на хемилюминометре. Система метаболитов активированного кислорода занимает основное место в механизмах бактерицидности нейтрофила. Метод хемилюминесценции нейтрофилов используется для оценки состояния кислородзависимых бактерицидных систем нейтрофила. В анализе используется цельная кровь, взятая в пробирку с антикоагулянтом ЭДТА.
Подготовка к работе хемилюминометра. Включить за 30 мин. до начала исследования. Выставить на панели прибора необходимую температуру (для данной реакции при t = 37°С). При появлении заданной температуры можно приступать к анализу. Одновременно с прогревом прибора произвести программирование опыта:
1. Составить протокол, указать имя файла, меню (контроли положительные, отрицательные), список пациентов, формулу расчета, работу диспенсеров, дозу ФМА;
2. Подготовить образцы пациентов к исследованию. Образцы цельной крови внести в пластмассовые пробирки хемилюминометра (реакционные пробирки), разбавить их в соотношении 1:100 раствором Хенкса (2 мкл крови и 200 мкл раствора Хенкса);
3. Приготовить контрольные образцы:
- 1-я пробирка – хемилюминесцентная пустая (бланк),
- во 2-ю пробирку внести 400 мкл раствора Хенкса,
- в 3-ю пробирку внести 200 мкл раствора Хенкса и 200 мкл рабочего раствора люминола (2-я и 3-я пробирки являются контролем неспецифической хемилюминесценции).
Техника постановки анализа:
1. Перенести пробирки с образцами и контрольным материалом в прибор. В первые три гнезда поставить контрольные пробирки, в остальные – разведенные образцы цельной крови пациентов;
2. Включить сигнал «старт» прибора. На этом этапе реакции через 20 – 40 мин. определяется спонтанная хемилюминесценция (адгезия – прикрепление клеток крови к стенкам пробирок);
3. После окончания времени спонтанной хемилюминесценции в автоматическом режиме в каждую пробирку подается 50 мкл рабочего раствора ФМА, являющегося стимулятором. Затем в кинетическом режиме фиксируется активность стимулированного (индуцированного) нейтрофила – индуцированная хемилюминесценция;
4. По окончании реакции результаты автоматически распечатываются (запрограммированные показатели: спонтанная или индуцированная хемилюминесценция). Определяется также индекс стимуляции – отношение процента положительных клеток в индуцированной XЛ к проценту положительных клеток в спонтанной XЛ. Спонтанная хемилюминесценция свидетельствует о «метаболическом взрыве», возникающем в нейтрофиле в связи с фагоцитозом. При стимуляции активность нейтрофилов возрастает. Индуцированная (стимулированная) хемилюминесценция характеризует резервы бактерицидной функции нейтрофилов. В комплексе с другими – ме-тод определения фагоцитоза позволяет прогнозировать течение за-болевания и оценивать эффективность терапии.
Контроль качества:
- оценить данные результатов контрольных проб;
- внести значения контрольных материалов на построенной карте Шухарта, при каждой постановке анализа;
- оформить бланки направлений пациентов.
У здоровых лиц значения хемилюминесценции (XЛ) соответствуют (табл.2):
Таблица 2
Исследуемый материал
| Спонтанная
ХЛ
| Индуцированная ХЛ
| Индекс
стимуляции (ИС)
| кровь (1:100)
усл. ед.
| 0,3–1,5
| 1,7–50,0
| >5,0
| популяция
нейтрофилов
(усл. ед.)
|
1–7
|
7–50
|
>9
| 6. Изучить метод НСТ (записать в тетрадь, оформить протокол)
НСТ – тест основан на способности нейтрофилов поглощать тетразолий синий (НСТ) и восстанавливать его в гранулы нерастворимого диформазана. Восстановление НСТ обеспечивается энергией и продуктами окислительно-восстановительных реакций «метаболического взрыва», сопровождающего процесс фагоцитоза, а также повышенного метаболизма активированного нейтрофила.
Техника постановки анализа
В две пробирки внести по 0,1 мл гепаринизированной крови или лейковзвеси и добавить по 0,1 мл инкубационной смеси: в 1-ю пробирку внести 0,1 мл ФСБ (спонтанный НСТ-тест); во 2-ю – 0,1 мл взвеси зимозана (250 мкг/мл) или декстрана сульфата (300 мкг/мл) – стимулированный НСТ-тест. Пробирки инкубировать 20 мин. при t 37°С, затем центрифугировать и из осадка сделать мазки. Мазки высушивают, фиксируют 5 мин. метанолом, докрашивают в течение 10 мин. ядра 2% метиловым зеленым или 1% сафранином.
Учет результатов.
Подсчитывается 100 нейтрофилов и вычисляется процент клеток, содержащих включения диформазана в виде гранул или сплошных отложений; рассчитывается средний цитохимический коэффициент (СЦК) по формуле Астальди-Верга. Для этого клетки делятся на четыре группы по количеству гранул диформазана:
- с нулевой активностью (гранул нет) – 0;
- со слабо положительной реакцией (единичные гранулы) – 1+;
- с положительной реакцией (гранулы покрывают 50% площади цитоплазмы) – 2++;
- с резко положительной реакцией (более 50% площади цитоплазмы занято гранулами) – 3+++;
Для подсчета удобно пользоваться лабораторным счетчиком клеток:
- на 1-й клавише откладываются отрицательные клетки; (а
- на 2-й клавише – со слабой реакцией; (b)
- на 3-й клавише – с положительной реакцией; (с)
- на 4-й клавише – с резко положительной реакцией, (d)
В сумме (а+в+c+d) = 100, тогда процент положительных клеток (в+c+d) = 100 - а%.
Средний цитохроматический коэффициент (СЦК) = (1хв +2хс + 3хd) / 100.
Вычисляется индекс стимуляции (ИС):
ИС = процент полож. клеток в стимулированном НСТ тесте процент полож. клеток в спонтанном НСТ тесте
Контроль качества
Оценка результатов. В норме у здоровых людей процент нейтрофилов, спонтанно восстанавливающий НСТ до диформазана, не превышает 10%. В норме число НСТ положительных нейтрофилов в результате стимуляции возрастает до 40–80%, индекс стимуляции составляет 5–10. Снижение показателей НСТ-теста указывает на уменьшение спонтанной и стимулированной фагоцитарной и бактерицидной функций. Это может быть обусловлено патологией самих нейтрофилов или дефицитом гуморальных факторов, обеспечивающих нормальный фагоцитоз.
5. Подведение итогов занятия – 5 мин
Дата добавления: 2015-10-11 | Просмотры: 1608 | Нарушение авторских прав
|