АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

ОСОБЕННОСТИ ИММУНИТЕТА ПРИ ГРИБКОВЫХ ИНФЕКЦИЯХ

Антигенные свойства грибов в сравнении со многими бактериями менее выражены, поэтому напряженность иммунного ответа при грибковых заболе-ваниях (микозах) относительно невысока. В настоящее время признано, что при микозах основные защитные механизмы обеспечиваются клеточными факторами и меньше - гуморальными. Неспецифические тканевые реакции на присутствие грибкового антигена, препятствующие проникновению патогенного гриба в органы и ткани, проявляются в виде развития эпителиоидной гранулематозной реакции, фагоцитоза, иногда тромбоза кровеносных сосудов за счет действия грибковых протеаз, обеспечивающих ускорение реакций свертывания крови

При врожденных и приобретенных иммунодефицитных состояниях иммунный ответ неполноценен или совсем неэффективен. При этом увеличивается опасность возникновения микозов, вызываемых условно-патогенными грибами. Например, при лейкозах возможно развитие аспергиллеза, при лимфоме и СПИДе- крипто-коккоза, при дисгаммаглобулинемии - кандидоза и т. д.

В случаях контакта грибкового антигена с клеточными компонентами иммунной системы при микозах развивается реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), выявляемая через 10 - 14 дней после заражения. В составе антигенов различных патогенных (равно как и многих непатогенных) грибов имеются сходные детерминанты, снижающие специфичность аллерги- ческих проб, которые используются для диагностики грибковых заболеваний.

Титры антител (1gG, 1gМ) при микозах, как правило, невысоки. В сыворотках крови здоровых индивидуумов можно обнаружить нормальные антитела против некоторых грибов. Например, до 6 - 8 % образцов донорской крови могут содержать противокандидозные антитела в титрах до 1:10. Это, как правило, обусловливается постоянным присутствием дрожжеподобных грибов рода Сfndidа в составе нормальной микрофлоры. у части здоровых людей. Повышениый уровень антител класса Е имеет место при респираторной грибковой аллергии, а секреторных антител класса А - при кандидозных вагинитах. С внедрением различных биотехнологических процессов в производство, использующих грибы в качестве лродуцентов биологически активных веществ, возрастает опасность возникновения профессиональных микозов и особенно аллергических заболеваний на фоне респираторной сенсибилизации людей спорами и фрагментами мицелия грибов Аspergillus, Саndida, Fusarium, Мuсог, Реnicillium и др. Так, при содержании в 1 куб. м воздуха производственных помещений до 15 млн грибных спор работающие там люди за 6 часов вдыхают до 170 - 200 млн спор, что приводит к аллергическим заболеваниям.

ОСОБЕННОСТИ ИММУНИТЕТА ПРИ ПРОТОЗОЙНЫХ ИНВАЗИЯХ.

Паразитирование простейших в организме человека и животных стимули-рует функционирование гуморальных и клеточных механизмов иммунитета. Однако их протективная роль при различных протозойных инфекциях неоди-накова. Она в значительной мере обусловлена физиологическими особен-ностями самих паразитов, их жизненным циклом, а также взаимоотношени-ями между паразитом и хозяином, формирующимися в процессе эволюцион-ного становления той или иной инфекции.

Как правило, паразитирование простейших приводит к появлению в крови позвоночного хозяина специфических антител 1gМ и 1gG, которые обнаружи-ваются при помоши современных серологических реакций: связывания комп-лемента, иммунофлюоресценции и др.

Некоторые простейшие (например, африканские трипаносомы - возбуди-тели сонной болезни) характеризуются высокой степенью изменчивости пове-рхностных антигенов, стимулирующих образование узкоспецифических антител, которые реагируют только с определенным вариантом поверх-ностного антигена. Повышение коннентрации специфических антител ведет к элиминации трипаносом соответствующего антигенного варианта, на смену которому появляется новый антигенный вариант - и цикл повторяется. Имму-нитет, защищающий от клинических проявлений малярии, вырабатывается только у лиц, достаточно долго живущих в очаге болезни и подвергаюшихся постоянной реинфекции посредством укусов зараженных малярийных комаров.

При лейшманиозах появление гуморальных антител 1gМ и 1gG свидете-льствует о персистировании паразита в организме хозяина в течение какого-то периода времени. При этом антитела не препятствуют успешному размно-жению паразитов и не оказывают заметного влияния на патогенез болезни. В отличие от сонной болезни и малярии лейшманиозы характеризуются появлением почти у всех переболевших хорошо выраженного стойкого иммунитета. Полагают, что иммунцтет при лейщманиозах имеет нестерильный характер, т. е. связан с бессимптомным, латентным персистированием пара-зитов (иногда пожизненным). Развивающийся при лейшманиозах протекти-вный иммунитет, очевидно, не связан с гуморальными антителами. В зтих слу- чаях превалирующее значение принадлежит сенсибилизированным лимфо-цитам. Последние, воздействуя на макрофаги, стимулируют способность этих клеток противостоять размножению в них амастигот лейшманий. Предполагают такие, что сенсибилизированные лимфоциты могут оказывать цитотоксическое действие на зараженные лейшманиями макрофаги и на паразитов, освобождающихся при их разрушении.

Активность функционирования механизмов клеточного иммунитета, с одной стороны, и состояние иммунологической толерантности, с другой, при лейшманиозах, токсоплазмозах и других протозойных инфекциях выявляют по наличию или отсутствию реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Так, например, отрицательная реакция ГЗТ, как правило, выявляется у больных индийским кала-азаром, эфиопским кожным лейшманиозом и некоторыми другими формами этой группы заболеваний.

Антигенная изменчивость в течение жизненного цикла, свойственная многим паразитическим простейшим, а также превалирование клеточных механизмов над гуморальными при формировании протективного иммунитета чрезвычайно осложняют задачу создания эффективных вакцин против протозойных инфекций.

Список литературы:

1. Петров Р.В.- Иммунология. М., Медицина. 1987.

2. Вершигора А.Е.- Общая иммунология. Киев., 1990.

3. Иммунология под. ред. У.Пола. М., Медицина, 1991.

4. Ройт. А., Основы иммунологии. М.,Медицина, 1992.

5. Фрималь Х., Брок И.- Основы иммунологии. М., 1986.

6. Борисов Л.Б., Смирнова А.М. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Учебник - М.,Медицина, 1994.

7. Коротяев А.И., Бабичев С.А.- Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. Учебник.-СПб: “Специальная литература”, 1998.

ЛЕКЦИЯ № 15

Тема Взаимодействие антигена с антителом. Применение реакций антиген-антитело в практике.

План лекции:

1.Серологические реакции.

1.1.Реакция агглютинации.

1.2.Реакция иммунного лизиса.

1.3. Реакция иммобилизации.

1.4. Опсонофагоцитарная реакция.

1.5. Реакция нейтрализации вирусов.

1.6. Реакции с участием меченных антигенов и антител.

1.6.1. Реакция иммунофлюоресценции.

1.6.2. Радиоиммунологический анализ.

1.6.3. Иммуноферментнывй анализ.

1.6.4. Получение моноклональный антител (гибридомная технология).

2. Вакцины, иммунные сыворотки, иммуноглобулины.

2.1. Вакцины.

2.2. Иммунные сыворотки и иммуноглобулины.

Иммунология является не только теоретическим, но и сугубо практическим разделом биологии и медицины. Реакции иммунитета легли в основу лабораторных методов диагностики инфекционных и неинфекционных заболеваний. Они используются для выявления специфических антител, идентификации возбудителей и других антигенов, определения групп крови и подбора адекватного донора при пересадках органов и тканей.

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

Реакции между антигенами и антителами in vitro, или серологические реакции, применяют для выявления неизвестного антигена или антитела с помощью известного антитела или антигена соответственно. В серологических реакциях можно определить титр антител в сыворотке крови при помощи известного антигена. С помощью антител, содержащихся в диагностических иммунных сыворотках, могут быть идентифицированы самые разнообразные антигены, в том числе патогенные микроорганизмы, и определен их серовариант (серовар). Серологические реакции дают возможность судить о динамике накопления антител в процессе заболевания, о напряженности иммунитета, возникающего после профилактических прививок.

Таким образом, серологические реакции в диагностических целях применяются: 1) для серодиагностики инфекционных заболеваний, т. е. для выявления антител с помощью набора известных антигенов и 2) для определения вида антигена (микроорганизма) или его серовара с помощью известных диагностических антисывороток.

Серологические реакции характеризуются: специфичностью и чувствительностью. Под специфичностью понимают способность антигенов реагировать только с гомологичными антителами. Ч у в с т- в и т е л ь н о с т ь характеризуется минимальным количеством антигенов или антител, которое выявляет данная реакция. Внешние проявления реакции зависят от свойств антител и антигенов и от условий постановки реакции. Корпускулярные антигены дают феномен агглютинации, растворимые - преципитации. В лабораторной практике используют реакции агглютинации, преципитации, связывания комплемента др.

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ

Реакция агглютинации (agglutinacio - склеивание) внешне проявляется в склеивании и выпадении в осадок корпускулярных антигенов: бактерий, эритроцитов, а также частиц с адсорбированными на них антигенами под влиянием антител в среде с электролитом. Реакция протекает в две фазы. В первой фазе происходит специфическая адсорбция антител на поверхности клетки или частицы, несущей соответствующие антигены, во второй - образование агрегата (агглютината) и выпадение его в осадок, причем этот процесс происходит только в присутствии электролита (раствор хлорида натрия).

Механизм реакции агглютинации описывается теорией решетки, согласно которой агглютинат образуется при соединении одного активного центра двухвалентного антитела с детерминантной группой одного антигена, а второго активного центра - с детерминантной группой другого антигена. Избыток, или недостаток антител препятствует проявлению агглютинации. Для постановки реакции агглютинации используют корпускулярные антигены (суспензии бактерий, эритроцитов). Характер

и скорость реакции зависят от антигенного строения бактериальной клетки. Мелкозернистую О-агглютинацию дают бактерии, лишенные жгутиков. О-агглютинация протекает медленно. При наличии Н-антигена реакция проявляется в образовании крупнохлопьевидного осадка и протекает значительно быстрее.

Реакция агглютинации недостаточно специфична и чувствительна. По данным признакам она уступает другим серологическим реакциям (преципитации, связывания комплемента и т. д.). Повысить специфичность и чувствительность реакции можно путем разведения исследуемой сыворотки до ее титра или половины титра. Ти- тром сыворотки называется то ее максимальное разведение, в котором обнаруживается агглютинация антигена. Чем выше титр антител, тем достовернее результаты реакции. Чтобы дифференцировать причину положительной реакции (ранее перенесенная инфекция, вакцинация или текущее заболевание), оценивают динамику нарастания титра антител,

которое наблюдается только при текущей инфекции.

При наличии у разных бактерий одинаковых или сходных групповых антигенов они могут агглютинироваться одной и той же антисывороткой, что затрудняет их идентификацию. В таких случаях применяют реакцию адсорбции агглютининов по Кастеллани. Данная реакция основана на способности родственных групп бактерий адсорбировать из антисыворотки только групповые антитела при сохранении в ней типоспецифических антител. Полученные сыворотки называются м о н о р е ц е п т о р н ы м и, так как содержат антитело только к одному определенному антигену. Они применяются для детального изучения антигенной структуры бактерий с целью определения их серовара.

Реакция непрямой, или пассивной, агглютинации (РНГА)

Под непрямой, или пассивной, агглютинацией понимают реакцию, в которой антитела взаимодействуют с антигенами, предварительно адсорбированными на клетках или частицах, которые при этом склеиваются. В качестве адсорбентов чаще всего применяют эритроциты различных животных, частицы целлюлозы, бентонита или латекса. В некоторых случаях пользуются обратным вариантом, т. е. адсорбируют на эритроцитах или иных частицах не антигены, а антитела. РНГА нашла широкое применение в серодиагностике различиых инфекций, а также для идентификации многих микроорганизмов благодаря очень высокой чувствительности и специфичности.

Реакция Кумбса (антиглобулиновый тест)

Реакцию используют для выявления неполных или блокирующих антител, которые образуются при различных патологических состояниях: резус-конфликте, аутоиммунных заболеваниях (системная красная волчанка, полиартрит и другие коллагенозы), при некоторых хронических инфекциях (бруцеллез). Для постановки реакции необходима антиглобулиновая сыворотка (АГС), которую получают путем иммунизации кролика человеческим глобулином. В АГС содержатся бивалентные антитела к любому человеческому глобулину, в том числе и к неполным антителам. При этом одна молекула иммуноглобулина АГС будет реагировать с двумя молекулами неполных антител, предварительно адсорбированными на корпускулярном антигене, в результате чего произойдет видимая реакция (агглютинация или гемагглютинация), по которой можно судить о наличии в исследуемой сыворотке неполных антител.

В случае развития у беременной с отрицательным резус-фактором плода с резус-положительным фактором в организме матери образуются неполные антитела в ответ на резус-антигены плода. Для обнаружения этих неполных антител в пробирку с сывороткой беременной вносят резус-положительные эритроциты (антиген), а затем АГС, в результате чего происходит гемагглютинация.

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ

Сущность данной реакции состоит в осаждении (преципитации) антигена, находящегося в дисперсном коллоидном состоянии, воздействием специфических антител в растворе электролита. Механизмы реакций агглютинации и преципитации аналогичны и описываются теорией “решетки”.

Реакция преципитации является высокочувствительным тестом, так как позволяет обнаружить ничтожно малые количества антигена или гаптена. Высокая чувствительность реакции преципитации позволяет использовать ее для выявления антигенов с помощью известных антисывороток. Для этого последовательные разведения антигена наслаивают на стандартное разведение диагностической сыворотки в пробирках, при этом осадок образуется в виде кольца на границе двух сред. Реакцию оценивают по максимальному разведению антигена, при котором наблюдается кольцо преципитации.

Реакция преципитации применяется в лабораторной практике при диагностике инфекционных заболеваний, а также в судебномедицинской экспертизе для определения видовой принадлежности белков, в частности белков кровяных пятен, спермы и т. д. С помощью этой реакции в санитарной практике определяют фальсификацию рыбных и мясных изделий. В биологии реакция преципитации используется для установления степени филогенетического родства различных видов животных и растений.

Иммунодиффузия

Метод простой линейной иммунодиффузии основан на взаимодействии антисыворотки, содержащейся в геле агар-агара с раствором антигена. В зависимости от специфичности заключенных в геле антител в ходе иммунодиффузии возникает одна или несколько полос преципитации, длина “пробега” которых от “линии старта” пропорциональна концентрации антигена. К усовершенствованным вариантам относятся: двойная радиальная иммунодиффузия (по Оухтерлони) и простая радиальная иммунодиффузия (по Манчини). Различают простую и двойную иммунодиффузию. В первом случае диффундирует один компонент, во втором - оба. Основная функция геля - локализация преципитата, основана на том, что растворимые антигены и антитела легко диффундируют в геле, а образующиеся иммунные комплексы ввиду их большей величины задерживаются внутри ячеек геля, образуют линии и полосы преципитации. Судя по ширине зон преципитации в тесте простой радиальной диффузии, можно

проводить количественное определение антигенов. Взаимное расположение линий преципитации в тестах двойной и встречной иммунодиффузии позволяет оценивать иммунохимическое сходство или различие антигенных компонентов. Методы иммунодиффузии характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью.

Обычно тесты иммунодиффузии используют для идентификации белков в биологических жидкостях, таких как сыворотка крови, цереброспинальная жидкость, секреты желез или экстракты различных органов и т. д.

Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) представляет собой сочетание электрофореза в агаровом геле с иммунодиффузией. Принцип ИЭФ состоит в следующем. Сначала проводят электрофоретическое разделение белков (смеси антигенов) в забуференном агаровом геле. Затем в канавку, которая идет параллельно направлению миграции белков, вносят преципитирующую иммунную сыворотку. Антигены и антитела диффундируют в геле навстречу друг другу, в месте их взаимодействия образуются дугообразные линии преципитации, количество, расположение и форма которых дают представление о составе исходной смеси антигенов. С помощью ИЭФ успешно анализируются белки сыворотки крови, спинномозговой жидкости, мочи, белки микробного происхождения. В клинической практике ИЭФ используют при диагностике иммунодефицитных состояний, проявляющихся дисгаммаглобулинемией.

В результате комбинации с другими методами анализа предложены диск-иммуноэлектрофорез, иммуноэлектрофокусирование, ракетный иммуноэлектрофорез, радиоиммуноэлектрофорез, иммуноблоттинг.

РЕАКЦИИ ФЛОККУЛЯЦИИ

И НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ТОКСИНА АНТИТОКСИНОМ

Реакция флоккуляции основана на способности токсина или анатоксина при смешивании в эквивалентных соотношениях с антитоксической сывороткой образовывать помутнение, а затем рыхлый осадок (флоккулят). Механизм реакции флоккуляции аналогичен таковому реакции преципитации. Эта реакция применяется для титрования антитоксических сывороток, токсинов и анатоксинов.

Реакция нейтрализации in vivo основана на способности антитоксической сыворотки нейтрализовать летальное действие токсина. Она применяется для титрования антитоксических сывороток и определения типа токсина.

При определении типа токсин смешивают с диагностической антитоксической сывороткой. Затем смесь вводят белым мышам. При соответствии типа токсина и антитоксической сыворотки мыши не погибают.

Для определения напряженности антитоксического иммунитета против дифтерии или скарлатины у детей используют кожные реакции Шика или Дика соответственно. Для этого в области предплечья внутрикожно вводят определенное количество (кожная доза) соответствующего токсина. Отсутствие покраснения и припухлости на месте инъекции свидетельствует о полной нейтрализации введенного токсина циркулирующими в организме антитоксинами. Один из общепринятых вариантов реакции нейтрализации токсина антитоксином - реакция нейтрализации гемолитических свойств токсина специфической иммунной сывороткой.

РЕАКЦИЯ ИММУННОГО ЛИЗИСА

В основе реакции лежит способность специфических антител образовывать иммунные комплексы с клетками, в том числе с эритроцитами, бактериями, что приводит к активации системы комплемента по классическому пути и лизису клеток. Из реакций иммунного лизиса чаще других применяется реакция гемолиза и редко - реакция бактериолиза (главным образом, при дифференциации холерных и холероподобных вибрионов).

Реакция гемолиза. Под влиянием реакции с антителами в присутствии комплемента мутная взвесь эритроцитов превращается в ярко-красную прозрачную жидкость - лаковую кровь вследствие выхода гемоглобина. При постановке диагностической реакции связывания комплемента (РСК) реакция гемолиза используется как индикаторная: для тестирования присутствия или отсутствия (связывание) свободного комплемента.

Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне) является одним из вариантов реакции гемолиза. Она позволяет определить число антителообразующих клеток в лимфоидных органах. Количество клеток, секретирующих антитела - гемолизины, определяют по числу бляшек гемолиза, возникающих в агаровом геле, содержащем эритроциты, суспензию клеток исследуемой лимфоидной ткани и комплемент.

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК)

При образовании комплекса антиген - антитело происходит связывание комплемента, причем этот процесс не всегда проявляется визуально. Для выявления реакции используют индикаторную гемолитическую систему - эритроциты барана, сенсибилизированные гемолитической антисывороткой кролика. При внесении сенсибилизированных антителами эритроцитов в пробирку, в которой предварительно инкубировали исследуемую сыворотку с антигеном и комплементом, гемолиз произойдет только при наличии свободного комплемента (реакция отрицательная). В случае, если комплемент уже был предварительно связан комплексами антиген - антитело, гемолиза не будет (реакция положительная).

РСК является одной из наиболее распространенных серологических реакций для определения природы и количества антител или антигенов. Универсальность, достаточно высокая чувствительность и специфичность РСК позволяют использовать ее для серодиагностики бактериальных, вирусных и микоплазменных инфекционных заболеваний.

РЕАКЦИЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ

Способность антисыворотки вызывать иммобилизацию подвижных микроорганизмов связана с реакцией между микробными антигенами и специфическими антителами в присутствии комплемента. Иммобилизующие антитела обнаружены при сифилисе, холере и некоторых других инфекционных заболеваыиях, возбудители которых являются подвижными микроорганизмами.

ОПСОНОФАГОЦИТАРНАЯ РЕАКЦИЯ

Для количественной оценки фагоцитарной активности рассчитывают среднее количество захваченных бактерий на один лейкоцит и содержание фагоцитирующих клеток. О наличии антител-опсонинов в исследуемой сыворотке крови судят по повышению фагоцитарной активности лейкоцитов в присутствии сыворотки.

РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ВИРУСОВ

В сыворотке крови иммунизированных людей или перенесших вирусное заболевание обнаруживают антитела, способные нейтрализовать инфекционность вирусов. Эти антитела обычно выявляются при смешивании иммунной сыворотки с соответствующим вирусом с последующим введением этой смеси восприимчивым лабораторным животным или заражением культуры клеток. На основании выживания животного в первом случае или отсутствия цитопатического действия вируса во втором судят о нейтрализующей активности сыворотки. Реакция широко применяется в вирусологии для определения вида (типа) возбудителя и титра вируснейтрализующих антител.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на свойстве антисыворотки подавлять вирусную гемагглютинацию, так как нейтрализованный специфическими антителами вирус утрачивает способность агглютинировать эритроциты. РТГА широко применяется для серодиагностики вирусных инфекций с целью обнаружения специфических антигемагглютининов и для идентификации многих вирусов по их гемагглютининам (антигенам).

РЕАКЦИИ С УЧАСТИЕМ МЕЧЕНЫХ АНТИГЕНОВ

ИЛИ АНТИТЕЛ

В настоящее время широкое применение получили серологические реакции, в которых участвуют меченые антигены или антитела. К ним относятся реакции иммунофлюоресценции, радиоиммунный и иммуноферментный методы. По своей чувствительности они превосходят все описанные выше серологические реакции.

Реакции иммунофлюоресценции (по Кунсу)

Для выявления микробных антигенов в тканях или патологическом материале можно использовать меченую диагностическую сыворотку, содержащую антитела к определенным видам (вариантам) микроорганизмов (бактерий, вирусов и др.). Метку антител производят флюорохромами (изотиоцианат флюоресцеина и др.) - прямой метод Кунса.

В связи с трудностями приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток более доступным является непрямой метод Кунса. Его постановка требует лишь одной флюоресцирующей сыворотки - антиглобулиновой, содержащей антитела против кроличьих глобулинов, так как большинство диагностических антисывороток приготовляется путем иммунизации кроликов разными антигенами. При образовании комплексов антиген - антитело флюоресцирующие антиглобулиновые антитела фиксируются на них. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики, который по своей чувствительности и специфичности не уступает другим иммунологическим реакциям.

Радиоиммунологический анализ (РИА)

Характерной чертой радиоиммунологического анализа (РИА) является сочетание специфичности, свойственной иммунологическим реакциям, с простотой и высокой чувствительностью определения. По сравнению с обычными иммунологическими методами преимущество РИА состоит в том, что отсутствует необходимость оценивать протекающую реакцию по вторичным проявлениям, таким как агглютинация, преципитация, лизис эритроцитов.

В одном из вариантов РИА меченый и немеченый антигены конкурируют за ограниченное число участков связывания со специфическими антителами. Для того чтобы происходило конкурентное взаимодействие, должна существовать определенная степень родства между меченым и немеченым антигеном. После двух этапов инкубации антител сначала с исследуемым, а затем со стандартным меченым антигеном количество включившегося в состав иммунных комплексов меченого антигена будет обратно пропорционально количеству немеченого антигена в исследуемой пробе.

Твердофазный радиоиммунологический анализ. Многие полимеры (полиэтилен, полипропилен, полистирол) обладают способностью связывать антитела или антигены белковой природы. Связанный с твердой фазой комплекс антиген - антитело легко отделяется от несвязавшегося биологического материала и при этом обладает высокой стабильностью. Меченый антиген, необратимо связываясь с фиксированными на матрице антителами, позволяет проводить высокочувствительный анализ биологического материала.

Методы с использованием твердой фазы (пластмасса, целлюлоза, сефадекс) существенно упростили процесс и возможность автоматизации процедур.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Возможность использования ферментов в качестве метки в иммуноанализе обусловлена прежде всего их высокой каталитической активностью, позволяющей с помощью соответствующих субстратных систем определить концентрации фермента в растворе на уровне 10 моль/л и ниже. Принципиально решена проблема введения ферментной метки в молекулы антигенов и антител.

Наиболее широкое применение находит твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Он основан на том, что белки прочно адсорбируются на пластинках, например из поливинилхлорида. Один из наиболее распространенных на практике вариантов ИФА основан на использовании меченых ферментом специфических антител и иммобилизованных антител той же специфичности. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор с анализируемым антигеном. В процессе инкубации на твердой фазе образуются специфические комплексы антиген - антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют гомологичные антитела, меченные ферментом, которые связываются со свободными валентностями антигена в составе комплексов. После вторичной инкубации и удаления избытка этих меченных ферментом антител определяют ферментативную активность на носителе, величина которой будет пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена.

При другом варианте ИФА к иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку. После инкубации и удаления несвязавшихся компонентов с помощью меченных ферментом антивидовых антител выявляют специфические иммунокомплексы. Данная схема является одной из наиболее распространенных в ИФА.

С целью максимального упрощения использования ИФА разрабатываются так называемые безреагентные системы, в которых все необходимые компоненты иммобилизованы или импрегнированы в пористую поверхность. Для проведения анализа необходимо только нанести на носитель образец и визуально наблюдать изменение окраски носителя, происходящее вследствие образования продукта ферментативной реакции.

Области применения и чувствительность ИФА аналогичны РИА. Однако ИФА по сравнению с РИА обладает целым рядом преимуществ: не используются радиоактивные изотопы, стабильность конъюгатов позволяет хранить их в течение длительного времени, измерение оптической плотности проводят в оптическом диапазоне, результаты ИФА можно оценивать полуколичественно без применения аппаратуры (визуально). ИФА очень легко поддается автоматизации.

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

(ГИБРИДОМНАЯ ТЕХНОЛОГИЯ)

Для большинства иммунологических и серологических методов исследования необходимо иметь соответствующие стандартные антисыворотки. Основные требования к таким сывороткам - специфичность и достаточное содержание антител. Сложность получения таких антисывороток путем иммунизации животных связана с проблемой гетерогенности антител. Это значит, что к одной и той же антигенной детерминанте может образоваться до 8000 вариантов молекул антител. В связи с этим невозможно получить антисыворотки от разных индивидуумов, содержащих одинаковые наборы антител. Эта сложность получения стандартных антисывороток преодолевается с помощью гибридомной техники получения моноклональных антител.

В 1975 г. Г. Келер и К. Мильштейн впервые добились слияния короткоживущих лимфоцитов, продуцирующих антитела, и перевиваемых клеток плазмоцитомы. Таким образом были получены теоретически “бессмертные” клоны гибридных клеток - продуценты моноклональных антител (гибридомы). Моноклональные антитела, продуцируемые определенной гибридомой, идентичны по специфичности, классу, молекулярной структуре.

Клетки из селезенки мышей, предварительно иммунизированных антигеном, сливаются с клетками миеломы, которые способны размножаться в клеточной культуре. Получаемые при этом гибридные линии клеток наследуют родительские свойства - способность к опухолевому росту и образованию специфических антител.

Клетки-гибридомы селекционируют на селективной питательной среде, где отмирают родительские плазмоцитомные клетки, имеющие определенные метаболические дефекты (ГАТ-S- клетки, т. е. не способные размножаться в присутствии комплекса гипоксантин - аминоптерин - тимидин), а выживают лишь гибридомные клетки. Среди растущих на селективной среде гибридомных клеток селекционируют клоны, которые продуцируют антитела определенной специфичности и определенного класса (IgG или IgM). Отобранные гибридомы - антителопродуценты можно культивировать in vivo или in vitro, получая моноклональные антитела соответственно из асцитной жидкости или из надосадочной жидкости культуральной среды.

Основные преимущества моноклональных антител - это их узкая специфичность, молекулярная однородность, возможность получения в больших количествах при сравнительно низкой себестоимости. Возможность длительного сохранения гибридом в замороженном состоянии позволяет использовать их в долгосрочных исследованиях и получать воспроизводимые результаты.

ВАКЦИНЫ. ИММУННЫЕ СЫВОРОТКИ.

ИММУНОГЛОБУЛИНЫ.

Одним из важнейших направлений прикладной микробиологии является создание эффективных препаратов для иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных заболеваний. Среди таких препаратов различают: 1) вакцины и анатоксины - препараты для индукции в организме специфического иммунного ответа с формированием активного противоинфекционного иммунитета за счет мобилизации механизмов иммунологической памяти; 2) иммунные сыворотки и иммуноглобулины - препараты, содержащие готовые специфические антитела (иммуноглобулины), введение которых в организм приводит к немедленному приобретению пассивного гуморального иммунитета, способного защитить организм от интоксикации или инфекции.

ВАКЦИНЫ

Название вакцины было дано Л. Пастером всем прививочным препаратам, полученным из микроорганизмов и их продуктов. Э. Дженнером была получена первая живая вакцина, содержащая вирус коровьей оспы (vaccinus - коровий), идентичный по антигенным свойствам вирусу натуральной оспы человека, но маловирулентный для человека. Таким образом, первый вакцинный штамм был заимствован из природы. Заслугай Л. Пастера была разработка принципов направленного получения вакцинных штаммов - селекция спонтанных мутантов с пониженной вирулентностью и сохранными иммуногенными свойствами путем культивирования их в определенных условиях или пассирования через организм устойчивых к данной инфекции животных. Исходя из этих принципов были получены вакцины первого поколения: против бешенства, туберкулеза, чумы, туляремии, сибирской язвы, полиомиелита, кори, паротита и др. Живые вакцины создают, как правило, напряженный иммунитет, сходный с постинфекционным. В большинстве случаев достаточно бывает однократной вакцинации живой вакциной, так как вакцинный штамм может размножаться и персистировать в организме. Применение живых вакцин опасно для людей (особенно детей) с врожденными или приобретенными иммунодефицитными состояниями, на фоне которых возбудители с пониженной вирулентностью могут вызвать тяжелые инфекционные осложнения.

Убитые вакцины готовят из микроорганизмов, обладаюших максимально выраженной иммуногенностью, инактивированных прогреванием, УФ-лучами или химическими веществами (формалином, фенолом, спиртом и др.) в условиях, исключающих денатурацию антигенов. Примерами убитых вакцин могут служить вакцины против коклюша, лептоспироза, клещевого энцефалита. Следует учитывать, что аттенуированный или убитый возбудитель, с точки зрения современной иммунологии, это множество различных антигенных детерминант, из которых “протективностью”, т.е. способностью индуцировать защитный иммунитет, обладают очень немногие. В связи с этим целесообразно усовершенствование вакцин путем использования компонентов бактериальных клеток и вирионов, обладающих наиболее выраженным протективным действием, и очистки вакцинных препаратов от токсичных или аллергизирующих компонентов. Выделение из бактериальных клеток компонентов, соответствующих протективным антигенам, позволило получить вакцины второго поколения - химические. По сравнению с убитыми и живыми вакцинами химические вакцины менее реактогенны. Примером может служить холерная вакцина, которая состоит из двух компонентов: холерогена-анатоксина и ЛПС, извлеченного из холерных вибрионов. Аналогами бактериальных химических вакцин являются вирусные субъединичные (расщепленные) вакцины, содержащие лишь некоторые наиболее иммуногенные компоненты вирионов. Примером является противогриппозная вакцина, включающая гемагглютинин и нейраминидазу, т. е. именно те антигены, против которых вырабатываются вируснейтрализующие антитела. Субъединичные вакцины оказались наименее реактогенными, но и наименее иммуногенными.

Для повышения иммуногенности химических и субъединичных вакцин к ним добавляют разного рода а д ъ ю в а н т ы (adjuvans- помогающий, поддерживающий): гидрооксид алюминия, алюминиево-калиевые квасцы, фосфат алюминия и др. Те же адъюванты добавляют для повышения иммуногенности и к препаратам анатоксинов.

Анатоксины получают путем обработки токсинов формалином (0,3 % раствор) при температуре 37 'С в течение 30 дней. При этом токсин утрачивает ядовитость, но сохраняет способность индуцировать синтез антитоксических антител. Анатоксинами широко пользуются для выработки активного антитоксического иммунитета при специфической профилактике столбняка, дифтерии и других инфекций, возбудители которых продуцируют экзотоксины.

Достижения современной фундаментальной иммунологии и молекулярной биологии позволяют получить в чистом виде антигенные детерминанты (эпитопы). Правда, изолированная антигенная детерминанта иммуногенностью не обладает. Поэтому создание вакцин новых поколений требует конъюгации антигенных детерминант с молекулой-носителем. В качестве носителей можно использовать как природные белки, так и синтетические полиэлектролиты. Конструирование таких искусственных вакцин позволяет соединить несколько эпитопов разной специфичности общим носителем, ввести в такой комплекс необходимую адъювантную группировку.

Другой принцип используется при создании вакцин следующего поколения - генноинженерных: на основе картирования геномов микроорганизмов гены, контролирующие нужные антигенные детерминанты, переносят в геном других микроорганизмов и клонируют в них, добиваясь экспрессии этих генов в новых условиях.

Сравнительно недавно была обоснована принципиальная возможность получения вакцин на основе антиидиотипических антител. Это объясняется близким структурным сходством между эпитопом антигена и активным центром антиидиотипического антитела, распознающим идиотипический эпитоп антитела к данному антигену. Показано, например, что антитела против антитоксического иммуноглобулина (антиидиотипические) могут иммунизировать животное подобно анатоксину.

Вакцинация должна обеспечивать доставку антигенных эпитопов к иммунокомпетентным клеткам, при этом необходимо исключить возможность изменения их структуры под действием ферментов. Одно из перспективных решений этой проблемы связано с использованием липосом - микроскопических пузырьков, состоящих из двуслойных фосфолипидных мембран. Благодаря их сходству с клеточными мембранами липосомы не токсичны для организма, а заключенное в них вещество защищено от разбавления и деградации в крови. Липосомы способны адсорбироваться на клетках, причем их содержимое медленно поступает внутрь клетки. Фагоцитирующие клетки могут захватывать липосомы путем эндоцитоза с последующей деградацией их мембран. Антигены, включенные в состав поверхностной мембраны липосом, приобретают свойства адъюванта - способность вызывать сильный иммунный ответ. Другие антигены можно вводить в содержимое липосом. В эксперименте такие липосомные вакцины вызывали тысячекратное усиление иммунного ответа.

Часть вакцин используется для обязательной плановой вакцинации детского населения: противотуберкулезная вакцина ВСG, полиомиелитная вакцина, коревая, паротитная, АКДС.

Другие вакцины обязательны для введения определенным контингентам в определенных районах (например, вакцина против клещевого энцефалита) или при опасности профессиональных контактов с возбудителем (например, вакцины против зооантропонозных инфекций). Только по эпидемиологическим показаниям начинают применять вакцины, предназначенные для предупреждения распространения эпидемий, например эпидемии гриппа.

При необходимости проведения массовой вакцинации населения по эпидемиологическим показаниям в настоящее время применяют безыгольный струйный инъектор. В основе безыгольного метода введения препарата лежит способность тонкой струи жидкости, выходящей под большим давлением, пробивать кожу и проникать на определенную глубину. Преимуществами такого метода являются: высокая производительность и экономичность, техническая простота соблюдения стерильности, исключение возможности передачи так называемых “шприцевых” инфекций (гепатит В, СПИД) и безболезненность. Общими требованиями вакцинным препаратам являются: высокая иммуногенность (способность обеспечивать надежную противоинфекционную защиту), ареактогенность (отсутствие выраженных побочных реакций), безвредность и минимальное сенсибилизирующее действие.

До настоящего времени далеко не все вакцинные препараты отвечают этим требованиям. Применение многих вакцинных препаратов у определенной части вакцинированных людей сопровождается побочными реакциями и осложнениями. Частично осложнения являются следствием антигенной перегрузки, особенно у детей 1-го года жизни. В течение 1-го года жизни ребенок, как правило, получает 4 - 5 вакцинных препаратов. В течение первых 10 лет жизни “календарь прививок” создает высокую антигенную нагрузку на иммунную систему детского организма. Результатом может быть сенсибилизация, сопровождающаяся развитием гетероаллергии. Некоторые живые вакцины (против бешенства, против желтой лихорадки) у детей с иммунодефицитными состояниями оказываются энцефалитогенными. Осложнения при плановой вакцинации могут быть связаны с несоблюдением противопоказаний. К числу отдаленных осложнений вакцинации можно отнести развитие аутоиммунных заболеваний за счет действия перекрестно реагирующих антигенов в составе некоторых вакцин.

Значительно более ограничено применение вакцин с целью иммунотерапии, в основном при инфекциях с хроническим, затяжным течением. С этой целью применяют, например, убитые вакцины: стафилококковую, гонококковую, бруцеллезную. В одних случаях курс вакцинотерапии может оказывать иммуностимулирующее, в других - десенсибилизирующее действие.

ИММУННЫЕ СЫВОРОТКИ И ИММУНОГЛОБУЛИНЫ

При многих бактериальных и вирусных ннфекциях антитела играют защитную роль, нейтрализуя экзотоксины и внеклеточные вирусы, способствуя очищению организма от бактерий. Однако накопление достаточного количества антител наблюдается, как правило, не ранее чем через 2 - 3 нед. после начала заболевания. Поэтому искусственное создание пассивного иммунитета путем введения препаратов иммунных сывороток или иммуноглобулинов показано при многих инфекциях как с целью серотерапии, так и с целью экстренной серопрофилактики (при непосредственной угрозе заболевания).

Иммунные сыворотки получают путем многократной иммунизации (гипериммунизации) лошадей, от которых можно получить сравнительно много крови. Например, антитоксическую сыворотку получают путем гипериммунизации лошадей соответствующим анатоксином с последующей обработкой иммунной сыворотки для концентрации антител и очистки от балластных веществ методами ферментирования и диализа (“Диаферм”). Силу антитоксических сывороток измеряют в международных единицах (МЕ) по способности нейтрализовать определенную дозу токсина.

Поскольку антитоксические лошадиные сыворотки являются гетерологичными, они могут вызывать, особенно при повторном введении в организм, аллергические реакции на чужеродный (лошадиный) белок. С этим связано правило обязательного предварительного контроля на чувствительность организма к лошадиному белку: путем постановки внутрикожной пробы с лошадиной сывороткой в разведении 1:100 в объеме 0,1 мл. Введение антитоксической лошадиной сыворотки допустимо лишь в случае отсутствия выраженной кожной реакции в течение 20 - 30 мин.

Целесообразно как можно более раннее введение антитоксических иммунных сывороток, начиная от момента заражения, так как антитела способны нейтрализовать ядовитое действие токсина только до его адсорбции на клетке-“мишени”.

Дальнейшее усовершенствование препаратов для создания пассивного иммунитета привело к выделению из иммунных сывороток очищенных и концентрированных препаратов - иммуноглобулинов. Расширяется использование гомологичных человеческих сывороток как основы для получения гомологичных иммуноглобулинов. Препараты иммуноглобулинов, полученные из нормальной или иммунной сыворотки и плазмы крови человека, в настоящее время широко применяются в медицинской практике.

Сырьем для приготовления нормального иммуноглобулина человека может служить пул плазмы крови доноров, пул сыворотки плацентарной крови. Использование нормального иммуноглобулина человека для экстренной профилактики и лечения кори, коклюша, менингококковой инфекции, полиомиелита, скарлатины обусловлено присутствием антител против соответствующих возбудителей в крови взрослых людей. Присутствие этих антител может быть результатом бытовой иммунизации, перенесенных инфекций или вакцинации против них.

От специально иммунизированных доноров получают сыворотку крови для приготовления иммуноглобулинов целенаправленного действия для экстренной профилактики и лечения столбняка, клещевого энцефалита, гриппа, стафилококковой инфекции. Противостолбнячный донорский иммуноглобулин используют для экстренной профилактики столбняка у лиц, у которых обнаружена повышенная чувствительность к лошадиному белку. Противоэнцефалитный иммуноглобулин получают из сывороток крови людей, проживающих в местах распространений данного заболевания, содержащих достаточно высокий уровень специфических противовирусных антител. Показанием к профилактическому введению такого препарата могут служить случаи выявления клещей на теле человека, находящегося в эндемическом районе.

Гетерологичные препараты иммуноглобулинов с высокими титрами специфических антител могут быть приготовлены из сывороток гипериммунизированных животных.

Перспективы дальнейшего совершенствования препаратов для создания пассивного иммунитета связаны с получением препаратов моноклональных антител на основе гибридов из клеток человека. Такие препараты будут обладать наиболее целенаправленным действием при минимальных возможностях осложнений.

Список литературы:

1. Петоров Р.В. - Иммунология., М., Медицина, 1987.

2. Вершигора А.Е.- Иммунология. Киев, 1990.

3. Иммунология под ред. У.Пола., М.,Медицина,1991.

4. Ройт А., Основы иммунологии.М., 1992.

5. Фрималь Х., Борок И., -Основы иммунологии., М., 1986.

6. Борисов Л.Б., Смирнова А.М. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Учебник- М., Медицина, 1994.

7. Коротяев А.И., Бабичев С.А.- Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. Учебник.-СПб.-№” Специальная литература”, 1998.

Дата добавления: 2014-12-12 | Просмотры: 1477 | Нарушение авторских прав