АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Реакція пасивної гемаглютинації. Компоненти. Застосування

Реакція непрямої (пасивної) гемаглютинації (РНГА, РПГА) заснована на використанні еритроцитів (або латексу) з адсорбованними на їх поверхні АГ або АТ, взаємодія яких з відповіними АТ або АГ сироватки крові хворих викликає склеювання і випадання еритроцитів на дно пробірки або комірки у вигляді фестончатого осаду.

Компоненти. Для постановки РНГА можуть бути використані еритроцити барана, коня, кролика, курки, миші, людини та ін, які заготовлюють взапас, обробляючи формаліном або глютаральдегідом. Адсорбційна ємність еритроцитів збільшується при обробці їх розчинами таніну або хлориду хрому.

АГ в РНГА можуть служити полісахаридні АГ мікроорганізмів, екстракти бактеріальних вакцин, АГ вірусів і рикетсій, а також інші речовини.

Еритроцити, сенсибілізовані АГ, називаються еритроцитарними діагностикумами. Для приготування еритроцитарного діагностикуму найчастіше використовують еритроцити барана, які мають високу адсорбуючу активність.

Застосування. РНГА застосовують для діагностики інфекційних хвороб, визначення гонадотропного гормона в сечі при встановленні вагітності, для виявлення підвищеної чутливості до лікарських препаратів, гормонів і т.д.

Механізм. РНГА відрізняється значно більш високою чутливістю і специфічністю, ніж реакція аглютинації. Її використовують для Ідентифікації збудника за його антигенною структурою або для індикації та ідентифікації бактеріальних продуктів - токсинів в досліджуваному патологічному матеріалі. Відповідно використовують стандартні (комерційні) еритроцитарні антитільні діагностикуми, отримані шляхом адсорбції специфічних АТ на поверхні танізованних (оброблених таніном) еритроцитів. У лунках пластмасових пластин готують послідовні розведення досліджуваного матеріалу. Потім в кожну лунку вносять однаковий обсяг 3% суспензії навантажених АТ еритроцитів. При необхідності реакцію ставлять паралельно в декількох рядах лунок з еритроцитами, навантаженими АТ різної групової специфічності.

Через 2 год інкубації при 37 ° С враховують результати, оцінюючи зовнішній вигляд осаду еритроцитів (без струшування): при негативній ​​реакції з'являється осад у вигляді компактного.диска або кільця на дні лунки, при позитивній реакції - характерний мереживний осад еритроцитів, тонка плівка з нерівними краями.

27. Реакція преципітації. Механізм. Компоненти. Способи постановки. Застосування.

Реакція преципітації (РП) - це формування і осадження комплексу розчинного молекулярного АГ з АТ у вигляді помутніння, який зветься преципітатом. Він утворюється при змішуванні АГ і АТ в еквівалентних кількостях; надлишок одного з них знижує рівень утворення імунного комплексу.

РП ставлять в пробірках (реакція кільцепреціпітаціі), в гелях, поживних середовищах та ін Широке поширення отримали різновиди РП в напіврідкому гелі агару або агарози: подвійна імунодифузія по Оухтерлоні, радіальна імунодифузія, імуноелектрофорез та ін

Механізм. Проводиться з прозорими колоїдними розчинними АГ, екстрагованих з патологічного матеріалу, об'єктів зовнішнього середовища або чистих культур бактерій. В реакції використовують прозорі діагностичні преципітуючі сироватки з високими титрами АТ. За титр преципітуючих сироватки приймають найбільше розведення антигену, яке при взаємодії з імунною сироваткою викликає утворення видимого преципітату - помутніння.

Реакція кільцепреціпітаціі ставиться у вузьких пробірках (діаметр 0,5 см), в які вносять по 0,2-0,3 мл преціпітуючої сироватки. Потім пастерівською піпеткою повільно напластовують 0,1-0,2 мл розчину АГ. Пробірки обережно перекладають у вертикальне положення. Облік реакції проводять через 1-2 хв. У разі позитивної реакції на кордоні між сироваткою і досліджуваним АГ з'являється преципітат у вигляді білого кільця. У контрольних пробірках преципітат не утворюється.

28. Імуноферментний аналіз або метод - виявлення АГ за допомогою відповідних їм антитіл, кон'югованих з ферментом-міткою (пероксидазою хрону, бета-галактозидаза або лужною фосфатазою). Після з'єднання антигену з міченим ферментом імунної сироватки в суміш додають субстрат / хромоген. Субстрат розщеплюється ферментом і змінюється колір продукту реакції - інтенсивність забарвлення прямо пропорційна кількості связаних молекул антигену і антитіл. ІФА застосовують для діагностики вірусних, бактеріальних і паразитарних захворювань, зокрема для діагностики ВІЛ-інфекцій, гепатиту В та ін, а також визначення гормонів, ферментів, лікарських препаратів та інших біологічно активних речовин, що містяться в досліджуваному матеріалі в мінорних концентраціях (1010-1012 г / л).

Твердофазний ІФА - варіант тесту, коли один з компонентів імунної реакції (антиген або антитіло) сорбований на твердому носії, напр., В лунках планшеток з полістиролу. Компоненти виявляють додаванням мічених антитіл чи антигенів. При позитивному результаті змінюється колір хромогена. Кожного разу після додавання чергового компонента з лунок видаляють незв'язані реагенти шляхом промивання,

I. При визначенні антитіл в лунки планшеток з сорбованим антигеном послідовно додають сироватку крові хворого, антиглобуліновой сироватку, мічену ферментом, і субстрат / хромоген для ферменту.

II. При визначенні антигену в лунки з сорбованими АТ вносять антиген, додають діагностичну сироватоку проти нього і вторинні антитіла, мічені ферментом, а потім субстрат / хромоген для ферменту.

Конкурентний ІФА для визначення антигенів: шуканий антиген і мічений ферментом антиген конкурують один з одним за зв'язування обмеженої кількості антитіл імунної сироватки.

Інший тест - Конкурентний ІФА для визначення антитіл: шукані антитіла і мічені ферментом антитіла конкурують один з одним за антигени, сорбовані на твердій фазі.

Імуноблотінг - високочутливий метод виявлення білків, заснований на поєднанні електрофорезу та ІФА або РІА. Імуноблотінг використовують як діагностичний метод при ВІЛ-інфекції та ін

Антигени збудника розділяють за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі, потім переносять їх з гелю на активований папір або нітроцелюлозну мембрану і проявляють за допомогою ІФА. Випускаються такі смужки з «блот» антигенів. На ці смужки наносять сироватку хворого. Потім, після інкубації, відмивають від незв'язаних антитіл хворого і наносять сироватку проти імуноглобулінів людини, мічену ферментом. Комплекс [антиген + антитіло хворого + антитіло проти Ig людини], який утвор на смужці виявляють додаванням хромогенного субстрату, що змінює забарвлення під дією ферменту.

29. Реакція зв'язування комплементу (РЗК) полягає у тому, що при відповідності один одному АГ і АТ утворюють імунний комплекс, до якого через Fc-фрагмент АТ приєднується комплемент (С), тобто відбувається зв'язування комплементу комплекс АГ -АТ. Якщо ж комплекс АГ-АТне утвориться, то комплемент залишається вільним.

Специфічну взаємодію АГ і AT супроводжує адсорбція (зв'язування) комплементу. Оскільки процес пов'язування комплементу не проявляється візуально, Ж. Борде і О.Жангу запропонували використовувати як індикатор гемолітичну систему (еритроцити барана + гемолітична сироватка), яка показує, чи фіксований комплемент комплексом АГ-АТ. Якщо АГ і AT відповідають один одному, тобто утворився імунний комплекс, то комплемент зв'язується цим комплексом і гемоліз не відбувається. Якщо AT не відповідає АГ, то комплекс не утворюється і комплемент, залишаючись вільним, з'єднується з другою системою і викликає гемоліз.

Компоненти. РЗК відноситься до скланих серологічних реакцій. Для її проведення необхідні 5 інгредієнтів: АГ, AT і комплемент (перша система), еритроцити барана і гемолітична сироватка (друга система).

Антигеном для РЗК можуть бути культури різних вбитих мікроорганізмів, їх лізати, компоненти бактерій, патологічно змінених і нормальних органів, тканинних ліпідів, віруси і матеріали, які містять віруси.

В якості комплементу використовують свіжу або суху сироватку морської свинки.

Механізм. РЗК проводять в дві фази: 1 фаза - інкубація суміші, що містить 3 компоненти антиген + антитіло + комплемент; 2 фаза (індикаторна) - виявлення в суміші вільного комплементу шляхом додавання до неї гемолітичної системи, що складається з еритроцитів барана, і гемолітичної сироватки, яка містить АТ до них. У 1-й фазі реакції при утворенні комплексу антиген-антитіло відбувається зв'язування їм комплементу, і тоді в 2-й фазі гемоліз сенсибілізованих антитілами еритроцитів не відбудеться; реакція позитивна. Якщо антиген і антитіло не відповідають один одному, комплемент залишається вільним і в 2-й фазі приєднується до комплексу еритроцит-антиеритроцитарне антитіло, викликаючи гемоліз; реакція негативна.

Застосування. РЗК застосовують для діагностики багатьох інфекційних хвороб, зокрема сіфілісу (реакція Вассермана).

30. Імунофлюоресцентний метод (РІФ, реакція імунофлюоресценції, реакція Кунса) - метод виявлення специфічних Аг за допомогою Ат, кон'югованих з флюорохромами. Володіє високою чутливістю і специфічністю.

Застосовується для експрес-діагностики інфекційних захворювань (ідентифікація збудника в досліджуваному матеріалі), а також для визначення Ат і поверхневих рецепторів і маркерів лейкоцитів та ін кл.

Виявлення бактеріальних і вірусних АГ в інфекційних матеріалах, тканинах тварин і культурах клітин за допомогою флуоресцентних антитіл (сироваток) отримало широке застосування в діагностичній практиці. Приготування флюоресціюючих сироваток засноване на спроможності деяких флюорохромів вступати в хім зв'язок із сироватковими білками, не порушуючи їх імунологічної специфічності.

Розрізняють 3 різновиди методу: прямий, непрямий, з комплементом. Прямий метод РІФ заснований на тому, що АГ тканин чи мікроби, оброблені імунними сироватками з антитілами, міченими флюорохромами, здатні світитися в УФ-променях люмінесцентного мікроскопа. Бактерії в мазку, оброблені такою люминесціюючою сироваткою, світяться по периферії клітини у вигляді кайми зеленого кольору.

Непрямий метод РІФ полягає у виявленні комплексу АГ - АТ за допомогою антиглобулінової сироватки, міченої флюорохромами. Для цього мазки з суспензії мікробів обробляють антитілами антимікробної кролячої діагностичної сироватки. Потім антитіла, не пов'язаних антигенами мікробів, відмивають, а що залишилися на мікробах антитіла виявляють, обробляючи мазок антиглобуліновою сироваткою, міченою флюорохромами. В результаті утворюється комплекс мікроб + антимікробні кролячі антитіла + антикролячі антитіла, мічені флюорохромами. Цей комплекс спостерігають в люмінесцентному мікроскопі, як і при прямому методі.

Механізм. На предметному склі готують мазок з досліджуваного матеріалу, фіксують на полум'ї і обробляють імунною кролячою сироваткою, що містить антитіла проти антигенів збудника. Для утворення комплексу антиген - антитіло препарат поміщають у вологу камеру і інкубують при 37 ° С протягом 15 хв, після чого ретельно промивають изотонічним розчином хлориду натрію для видалення не зв'язаних з антигеном антитіл. Потім на препарат наносять флюоресціюючу антиглобулінову сироватку проти глобулінів кролика, витримують протягом 15 хв при 37 ° С, а потім препарат ретельно промивають ізотонічним розчином хлориду натрію. В результаті зв'язування флюоресціюючої антиглобулінової сироватки з фіксованими на АГ специфічними АТ утворюються і світяться комплекси антиген - антитіло, які виявляються при люмінесцентної мікроскопії

31. Реакція флокуляції. Феномен флокуляції - помутніння - зовнішній прояв утворення комплексу екзотоксин (анатоксин) + антитоксин в оптимальних кількісних співвідношеннях інгредієнтів.

Реакція застосовується:

- Для визначення специфічної активності токсинів (анатоксинів) за стандартною антитоксичною сироваткою (МО / мл), яка позначається ще імуногенною одиницею (ІО).- це та кількість токсину (анатоксину), яке дає інтенсивну, ініціальну флоккуляцію з 1МЕ сироватки;

- Для титрування антитоксичних сироваток за відомими анатоксином або токсином (метод Рамона). Активність сироваток виражається в МО / мл приймається та мінімальна кількість сироватки, яке дає інтенсивну «ініціальну» флокуляцію з Ш анатоксину (токсину). Наприклад, ця реакція застосовується для визначення активності дифтерійного, правцевого, ботулінічного, гангренозного анатоксинів та титрування протидифтерійної, протиправцевої, протиботулічної, протигангренної та ін антитоксичних сироваток.

32. Реакція нейтралізації має декілька варіантів:

РН вірусів – в основі лежить здатність специфічних АТ зв’язуватись з вірусами. В результаті віруси не можуть адсорбуватись на клітинах і розмножуватись.

Для постановки необхідна наявність вірусу, сироватки, яка містить АТ, і біологічного об’єкта, який виступає індикатором нейтралізації. Перед постановкою вірус попередньо титрують. РН ставлять таким чином: до послідовних розведень досліджуваних сироваток вносять по 100 ЦПД50 вірусу і обидва реагенти інкубують при Т 37° С протягом 1-2 год. Після чого до суміші додають суспензію клітин або суміш вводять в організм лабораторних тварин. Про наявність віруснейтралізуючих антитіл свідчить відсутність цитопатичної дії вірусу або проявів інфікування

РН токсину антитоксином.

В основі цієї реакції лежить здатність специфічної антитоксичної сироватки нейтралізувати екзотоксин.

АТ імунної сироватки здатні нейтралізувати шкідливу дію мікробів чи їхніх токсинів на чутливі клітини і тканини, що пов'язано з блокадою мікробних антигенів антитілами, тобто їх нейтралізацією.

Реакцію нейтралізації (РН) проводять шляхом введення суміші антиген-антитіло тваринам або в чутливі тест-об'єкти (культуру клітин, ембріони). За відсутності у тварин і тест-об'єктів ушкоджуючої дії мікроорганізмів або їх антигенів, токсинів говорять про нейтралізуючу дію імунної сироватки і, отже, про специфічність взаємодії комплексу антиген-антитіло.

Для проведення реакції досліджуваний матеріал, у якому передбачається наявність екзотоксину, змішують з антитоксичною сироваткою, витримують в термостаті і вводять тваринам (морським свинкам, мишам). Контрольним тваринам вводять фільтрат досліджуваного матеріалу, не оброблений сироваткою. У тому випадку, якщо відбудеться нейтралізація екзотоксину антитоксичною сироваткою, тварини дослідної групи залишаться живими. Контрольні тварини загинуть в результаті дії екзотоксину.

33 Реакция агглютинации. Компоненты, механизм, способы постановки. Применение.

Реакция агглютинации — простая по постановке реакция, при которой происходит связыва­ние антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекулярных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изо­тонического раствора натрия хлорида.

Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировоч­ная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осад­ка (клетки, «склеенные» антителами, име ющими два или более антигенсвязывающих центра — рис. 13.1). РА используют для:

1) определения антител в сыворотке крови боль­ных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реак­ция Видаля) и других инфекционных болезнях;

2) определения возбудителя, выделенного от больного;

3) определения групп крови с использова­нием моноклональных антител против алло-антигенов эритроцитов.

Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации: к разве­дениям сыворотки крови больного добавля­ют диагностикум (взвесь убитых микробов,) и через несколько часов инкубации при 37 ˚С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.

Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентиро­вочную реакцию агглютинации, применяя диа­гностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диа­гностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больно­го. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микроба­ми хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увели­чивающимися разведениями агглютинирую­щей сыворотки, к которым добавляют по 2—3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмеча­ется в разведении, близком к титру диагнос­тической сыворотки. Одновременно учитыва­ют контроли: сыворотка, разведенная изото­ническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе — равномерно мутной, без осадка.

34. Імунний статус: визначення, принципи та методи дослідження.

Иммунный статус — это структурное и функциональное состояние иммунной сис­темы индивидуума, определяемое комплек­сом клинических и лабораторных иммуно­логических показателей.

Таким образом, иммунный статус ха­рактеризует анатомо-функциональное состо­яние иммунной системы, т. е. ее способность к иммунному ответу на определенный анти­ген в данный момент времени.

На иммунный статус оказывают влияние следующие факторы:

• климато-географические; • социальные; • экологические (физические, химические и биологические); • «медицинские» (влияние лекарственных веществ, оперативные вмешательства, стресс и т. д.).

Несмотря на вариабельность иммуноло­гических показателей в норме, иммунный статус можно определить путем постановки комплекса лабораторных тестов, включаю­щих оценку состояния факторов неспецифи­ческой резистентности, гуморального (В-система) и клеточного (Т-система) иммунитета.

Оценка иммунного статуса проводится в кли­нике при трансплантации органов и тканей, аутоиммунных заболеваниях, аллергиях, для выявления иммунологической недостаточнос­ти при различных инфекционных и сомати­ческих заболеваниях, для контроля эффектив­ности лечения болезней, связанных с наруше­ниями иммунной системы. В зависимости от возможностей лаборатории оценка иммунного статуса чаше всего базируется на определении комплекса следующих показателей:

1) общего клинического обследования;

2) состояния факторов естественной резис­тентности;

3) гуморального иммунитета;

4) клеточного иммунитета;

5) дополнительных тестов.

При общем клиническом обследовании учи­тывают жалобы пациента, анамнез, клинические симптомы, результаты общего анализа крови (включая абсолютное число лимфоци­тов), данные биохимического исследования.

В качестве дополнительных тестов для оценки иммунного статуса можно использовать такие тесты, как определение бактерицидное™ сыво­ротки крови, титрование СЗ-, С4-компонентов комплемента, определение содержания С-реактивного белка в сыворотке крови, определение ревматоидных факторов и других аутоантител.

Таким образом, оценка иммунного статуса про­водится на основании постановки большого чис­ла лабораторных тестов, позволяющих оценить состояние как гуморального и клеточного звеньев иммунной системы, так и факторов неспецифи­ческой резистентности. Все тесты разделены на две группы: тесты 1-го и 2-го уровня. Тесты 1-го уровня могут быть выполнены в любой клинической иммуно­логической лаборатории первичного звена здра­воохранения, они используются для первичного выявления лиц с явно выраженной иммунопато­логией. Для более точной диагностики использу­ются тесты 2-го уровня.

35. Методи і цілі дослідження клітинної ланки імунітету.

Поскольку в формировании иммунитета принимают участие клетки иммунной сис­темы и гуморальные факторы, принято ак­тивный иммунитет дифференцировать в за­висимости от того, какой из компонентов иммунных реакций играет ведущую роль в формировании защиты от антигена. В связи с этим различают клеточный, гуморальный, клеточно-гуморальный и гуморально-клеточ-ный иммунитет.

Примером клеточного иммунитета может служить противоопухолевый, а также транс­плантационный иммунитет, когда ведущую роль в иммунитете играют цитотоксические Т-лимфоциты-киллеры; иммунитет при ток-синемических инфекциях (столбняк, боту­лизм, дифтерия) обусловлен в основном ан­тителами (антитоксинами); при туберкулезе ведущую роль играют иммунокомпетентные клетки (лимфоциты, фагоциты) с участием специфических антител; при некоторых ви­русных инфекциях (натуральная оспа, корь и др.) роль в защите играют специфические антитела, а также клетки иммунной системы

36. Методи і цілі дослідження гуморальної ланки імунітету.

Гуморальный иммунитет определяют по уров­ню иммуноглобулинов классов G, M, A, D, Е в сыворотке крови, количеству специфических антител, катаболизму иммуноглобулинов, ги­перчувствительности немедленного типа, пока­зателю В-лимфоцитов в периферической крови, бласттрансформации В-лимфоцитов под дейс­твием В-клеточных митогенов и другим тестам.

Состояние клеточного иммунитета оцени­вают по количеству Т-лимфоцитов, а также субпопуляций Т-лимфоцитов в периферичес­кой крови, бласттрансформации Т-лимфоци­тов под действием Т-клеточных митогенов, определению гормонов тимуса, уровню секретируемых цитокинов, а также постанов­кой кожных проб с аллергенами, контактной сенсибилизацией динитрохлорбензолом. Для постановки кожных аллергических проб ис­пользуются антигены, к которым в норме должна быть сенсибилизация, например про­ба Манту с туберкулином. Способность организма к индукции первичного иммунного от­вета может дать контактная сенсибилизация динитрохлорбензолом.

37. Лікувальні і профілактичні імунні сироватки: отримання, титрування. Механізм дії. Приклади. Профілактика ускладнень.

СИРОВАТКИ ІМУННІ ЛІКУВАЛЬНО-ПРОФІЛАКТИЧНІ — сироватки крові тварин і людини, що містять антитіла проти бактерій (антибактеріальні), вірусів (противірусні), екзотоксинів (антитоксичні), отрут змій, павуків та ін. Готують із крові гіпер­імунізованих тварин (зазвичай коней, мулів, буйволів), здорових людей, які в минулому перенесли інфекційне захворювання (у крові таких людей є антитіла проти його збудника), або спеціально імунізованих людей-донорів. Використовують для лікування й запобігання інфекційним захворюванням та токсикозів (дифтерія, правець, ботулізм, анаеробна газова інфекція, віспа, краснуха, грип, сказ, укус змій, отруйних павуків та ін.). Уводять підігрітими до температури тіла в/м, рідше — підшкірно; спеціальні препарати можна використовувати в/в. Перед уведенням сироваткові препарати оглядають. У нормі вони являють собою прозору або злегка опалесцентного жовтуватого кольору рідину. Сироватки, що містять осад, пластівці, частки, уламки скла, не мають етикеток, з терміном придатності, який минув, до застосування непридатні.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 1632 | Нарушение авторских прав