 |
|
АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология |
Основні набори дисків, які рекомендуються для визначення чутливості залежно від виду виділеної культури та патологічного матеріалу
Примітка. * – антибіотики, чутливість до яких визначають у першу чергу. Оцінку результатів проводять за таблицею 14, яка містить граничні значення діаметрів зон затримки росту для резистентних, помірно резистентних та чутли-вих штамів, а також значення мінімальної пригнічуючої (інгібуючої) концентрації (МПК, МІК) антибіотиків для стійких і чутливих штамів. Одержані значення діаметрів зон затримки росту порівнюють з контрольни-ми значеннями таблиці 14 і відносять досліджувані штами до однієї з трьох кате-горій чутливості. Метод дифузії за допомогою дисків є якісним методом. Він дозволяє встано-вити лише факт чутливості або резистентності збудників інфекції. Однак вста-новлений корелятивний зв’язок розмірів зон пригнічення росту досліджуваних штамів і значень МІК (мінімальна концентрація препарату, яка інгібує ріст дослі-джуваного штаму) антибіотиків дозволяє оцінити ступінь чутливості і кількісно, використовуючи дані, наведені у таблиці 14. За своїм ступенем чутливості до ан-тибіотиків мікроорганізми поділяються на три групи: Частина І. Загальна мікробіологія
Розділ 8. Визначення чутливості бактерій до антибіотиків 1 група – чутливі до антибіотиків (збудники знищуються в організмі при ви-користанні звичайних терапевтичних доз препаратів); 2 група – помірно-резистентні (для них лікувальний ефект може бути досяг-нутий при використанні максимальних терапевтичних доз препаратів); 3 група – резистентні (бактерицидних концентрацій препаратів в організмі створити неможливо, тому що вони будуть токсичними). При визначенні стійкості до антибіотиків, близьких за хімічною будовою і спектром антибактеріальної дії, можливе використання клас-диска, просякнутого одним з антибіотиків певної групи. Так, за допомогою диска з бензилпеніциліном можна визначати чутливість до біцилінів, феноксиметилпеніциліну; цефалекси-новим – до цефазоліну, цефаклору, цефалотину. Однак, не рекомендується вико-ристовувати тетрациклінові диски для визначення чутливості до доксицикліну. Строки та температура зберігання дисків вказані на етикетці упаковок. Дис-ки з малостабільними антибіотиками (бензилпеніциліном, ампіциліном, карбені-циліном, метициліном, оксациліном) слід зберігати при 4 °С або 14 °С. Після того, як флакон із дисками відкрито, його зберігають протягом тижня при 4 °С. Перед застосуванням його протягом 1 год залишають при кімнатній температурі для по-передження утворення конденсату на внутрішніх стінках флакона. Диски із про-строченим терміном зберігання, де сілікагель має рожевий колір, використовува-ти не можна. Метод серійних розведень. Показаннями для визначення антибіотикочутли-вості за методом серійних розведень є необхідність одержання кількісних даних (переважно при тяжкому перебігу інфекційних процесів) для проведення регульо-ваної антибіотикотерапії. Встановлення ступеня чутливості мікробів до антибактеріальних препаратів впливає на вибір антибіотика (наприклад, відмова від ліків з високою токсичні-стю при помірному ступені чутливості збудника до них), його дозування (концен-трація антибіотика в крові повинна в 2-3 рази перевищувати його мінімальну при-гнічуючу концентрацію по відношенню до збудника) і режим введення. Крім того, її кількісне визначення необхідне також для встановлення бактерицидної дії об-раного препарату (як гарантії швидкого терапевтичного ефекту та безрецидивно-го перебігу) по відношенню до даного збудника. Існують дві модифікації методу серійних розведень – визначення чутливості на рідкому та густому живильних середовищах. Метод дає можливість визначити МПК препарату для виділеного штаму збудника. Для визначення антибіотикочутливості за методом серійних розведень у рідкому живильному середовищі готують ряд (8-10 і більше) пробірок з двократ-ними послідовними розведеннями препарату (табл. 15). Середовище попередньо розливають у пробірки по 2 мл. У першу додають 2 мл розчину антибіотика певної концентрації, перемішують і переносять до на-ступної пробірки, продовжуючи розведення до передостанньої, з якої видаляють 2 мл суміші. Остання пробірка служить контролем росту культури. У тому ж бульй-оні, який використовують для розведення антибіотиків, готують суспензію добо- Частина І. Загальна мікробіологія
вої агарової або бульйонної культури бактерій з розрахунку 105-106 мікробних тіл в 1 мл залежно від виду збудника. Потім до кожної пробірки з розведеннями, а також до контрольної додають по 0,2 мл виготовленої суспензії. При визначенні чутливості до пеніцилінів пеніциліназоутворюючих стафілококів рекомендують використовувати одночасно велике й мале мікробне навантаження (100, 100000 та вище мікробних тіл в 1 мл). Залежно від величини посівної дози значення МПК препарату може коливатись: при збільшенні дози чутливість знижується за раху-нок зростання кількості пеніцилінази, що утворюється в середовищі. Пробірки інкубують у термостаті при 37 °С протягом 18-24 год. Ре зультати враховують, визначаючи наявність або відсутність росту в середовищі з різними розведеннями препарату. (рис. 41). Остання пробірка, в якій спостерігають зат-римку росту культури (прозорий бульйон), відповідає МПК (мінімальній пригнічу-ючій концентрації) або МБсК (мінімальній бактеріостатичній концентрації) пре-парату відносно даного мікроба і вказує на ступінь його чутливості. Якщо ознаки росту з’являються в усіх пробірках, досліджуваний штам резистентий до макси-мальної концентрації препарату, яку було взято у дослід. Відсутність росту бак-терій в усіх пробірках, крім контрольної, свідчить, що МПК препарату нижча, ніж та, що використовується в досліді.
Для визначення бактерицидного ефек-ту антибіотика з декількох останніх про-бірок, в яких немає ознак росту, роблять висів на сектори агару в чашках Петрі. Че-рез 24-48 год інкубації при оптимальній температурі відмічають ту найменшу кон-центрацію препарату в пробірці, посів з якої не дав росту. Її вважають мінімальною бак-терицидною концентрацією (МБцК).
Принцип методу серійних розведень у густому живильному середовищі анало- Розділ 8. Визначення чутливості бактерій до антибіотиків гічний попередньому. Для цього готують серію розведень антибіотика в агарі, до-даючи один об’єм, який містить певну кількість препарату до 9 об’ємів агару. Для цього зручно розлити агар у флакони або широкі пробірки по 13,5 мл. Перед по-становкою агар розплавляють на водяній бані і після охолодження до 60-65 °С у кожну пробірку додають 1,5 мл відповідного розведення антибіотика (в бульйо-ні), ретельно перемішують і виливають у чашку Петрі. У контрольну пробірку з агаром замість розчину антибіотика вносять 1,5 мл дистильованої води. Чашку поділяють на сектори, на кожний з яких засівають досліджуваний штам. Посіви роблять бактеріологічною петлею або пастерівською піпеткою. Для посіву зручно використати спеціальний штамп-реплікатор, який дозволяє нанести одночасно на поверхню агару 25-50 досліджуваних культур. Результати враховують після 18-24 год інкубації в термостаті при оптимальній температурі. За МПК антибіотика для даного штаму приймають ту, при якій відсутні ознаки росту колоній на поверхні агару (або замість бляшки є ріст поодиноких колоній). З двох способів визначення антибіотикочутливості мікробів до антибіотиків (розведень у густому та рідкому середовищах) більш точним є метод серійних розведень у рідкому середовищі. Результати, які одержують за допомогою розве-день в агарі, менш постійні. Метод не слід застосовувати при оцінці чутливості тих мікробів, які дають тонкий, розріджений ріст на поверхні чашки (стрептоко-ки, пневмококи) або, навпаки, мають тенденцію до повзучого росту (протей). Недоліком методів серійних розведень є їх висока трудоємність, що обмежує використання в звичайних бактеріологічних лабораторіях. З метою спрощення було запропоновано модифікацію методу із заміною ряду з 10 пробірок, що містять різні кількості препарату, трьома концентраціями антибіотика. Перша з них відпо-відає максимальній, що знаходиться у крові при введенні терапевтичних доз, дру-га – рівню, що спостерігається через Т1/2 (час зниження концентрації антибіотика на 50 %). Третя є мінімальною, тобто тою, яка дорівнює МПК для високочутливих штамів. У відповідності до використаних концентрацій антибіотиків досліджу-вані штами можна віднести за рівнем чутливості до трьох основних груп: резис-тентні (МПК для яких перевищує значення максимальної концентрації антибіоти-ка у крові), помірно чутливі (значення МПК наближаються до максимальної або середньої концентрації) і високочутливі (чутливість яких до антибіотика знахо-диться на рівні мінімальної концентрації, що використовується у досліді). Такими концентраціями при визначенні чутливості до бензилпеніциліну є відповідно 0,05-0,2, 0,5 і 2,0 ОД/мл, до макролідів – 0,1, 0,5-1,0 і 4,0 мкг/мл, до аміноглікозидів – 0,5-1,0, 6,0-8,0 і 15,0-20,0 мкг/мл. Прискорені методи визначення чутливості мікроорганізмів до антибіо-тиків. Використовуючи звичайні методи, відповідь може бути отримана через 18-20 год від початку дослідження, не враховуючи етапів виділення чистої культури. Це призводить до того, що у більшості випадків особливо при затяжному та тяж-ком у перебігу хвороби, лікування антибіотиками починають задовго до одержан-ня даних лабораторного обстеження. Залежно від принципів, на яких вони базу-ються, прискорені методи передбачають: Частина І. Загальна мікробіологія • визначення змін фермент ативної активності мікроорганізмів під вплив ом антибіотиків; • визначення кольору редокс-індикаторів при зміні окисно-відновного потен-ціалу під час росту бактерій у живильному середовищі; • цитологічну оцінку змін морфології бактеріальних клітин під впливом ан-тибіотиків. До першої групи належить метод Роджерса, орієнтований на здатність анти-біотиків пригнічувати ферментативну активність чутливих мікроорганізмів, що супроводжується зміною кольору відповідного індикатора. Суть його полягає у диференційованій зміні червоного кольору фенолового червоного на жовтий або фіолетовий залежно від чутливості досліджуваного штаму. У випадку чутливості до дії антибіотика не відбувається розкладання глюкози при культивуванні у сере-довищі, яке містить її та певні концентрації препарату. При цьому середовище забарвлюється у фіолетовий колір внаслідок зсуву рН у лужну сторону. Зміна чер-воного кольору на жовтий свідчить про розщеплення глюкози з утворенням кис-лоти внаслідок росту штаму, резистентного до дії антибіотика. Якщо до середови-ща додати 0,25 % дріжджового екстракту, результати можуть бути врахованими вже через 2-2,5 год від початку дослідження. Наступна група методів реєструє зміни окисно-відновного потенціалу сере-довища в процесі росту мікроорганізмів, про що свідчить зміна кольору резазури-ну, 1,3,5-трифенилтетразолію хлориду, 2,6-дихлорфеноліндофенолу та інших, які додаються до середовища. Цей метод технічно простий, а результати одержують через 2-6 год. Принцип його зводиться до того, що розтоплений та охолоджений до 50 °С агар засівають досліджуваною культурою бактерій із розрахунку 200 млн. мікробних тіл, а на поверхню накладають диски з антибіотиками. Чашки інкубу-ють при оптимальній температурі протягом 3-5 год, потім обробляють індикато-ром і повторно інкубують при 37 °С протягом 20-30 хв. Результати враховують за зміною кольору навколо дисків з антибіотиками. Якщо використовують 1 % роз-чин 1,3,5-трифенилтетразолію хлориду, ділянки агару з бактеріальним ростом внаслідок утворення формазану набувають червоного кольору, а зони пригнічен-ня росту навколо дисків залишаються безбарвними. Судити про ступінь чутливості мікробів до антибіотиків можна з такою ж точністю, як і за допомогою стандартного методу дисків, проте час дослідження зменшується до 3-5 год. Утворення інволюційних форм бактерій під впливом антибіотиків досліджу-ють під фазово-контрастним чи антоптральним мікроскопом у спеціальних мікро-капсулах. Вони утворюються внаслідок дії бактеріостатичних концентрацій пре-парату. Під впливом суббактеріостатичних концентрацій, а також при резистент-ності досліджуваного штаму на поверхні агару виростають нормальні мікроколонії. Метод може бути застосований для визначення чутливості штамів кишкової палички, стафілококів, холерних вібріонів. Отримані дані у більшості випадків збігаються з тими, які дають класичні методи. Розділ 8. Визначення чутливості бактерій до антибіотиків За останні роки розроблено численні модифікації методу серійних розведень у живильних бульйонах. Зокрема, експрес-методи з титруванням антибіотика в об’ємі 0,25 мл. Випускаються комерційні набори тривалого зберігання, які складаються з планшетів з ліофільно висушеними розведеннями антибіотика, куди вноситься по 0,1 мл суспензії чистої культури мікроорганізмів. Результати визначення антибіо-тикочутливості можна оцінювати візуально (при наявності у середовищі індика-тора) або за допомогою спектрофотометрів, коли реєструється зміна оптичної гу-стини середовища. Визначати чутливість бактерій до антибіотиків можна й за допомогою автома-тизованих мікробіологічних систем (“Autobac MS-2”, “Cobas Micro”, Quantum 2, Sceptor та ін.). При їх використанні результати отримують вже через 3-10 год. Одна з їх переваг полягає в тому, що вони дозволяють отримувати результати одночасно до 18-20 антибіотиків. Ці методи широко використовують у мікробіологічних ла-бораторіях, вони добре корелюють з іншими методиками і за їх допомогою можна не тільки вибирати раціональну схему антибіотикотерапії, але й проводити епіде-міологічний контроль резистентності. Однак при користуванні такими автоматизованими системами частота вияв-лення резистентних штамів може бути знижена внаслідок повільного росту стійких варіантів. У більшості подібних систем результати враховують шляхом порівнян-ня росту (або загибелі) бактеріальних клітин у присутності антибіотиків з контро-лем, де є тільки мікроби. За цих умов досить важко диференціювати клітини, які гинуть, від тих, що повільно розмножуються. До інших факторів, які впливають на результати, належить дія субінгібітор-них концентрацій препаратів на ультраструктуру бактеріальних клітин. Вони при-зводять до зміни форми, набухання клітин, що може супроводжуватись зміною оптичної густини суспензії та спотворенням результатів. В свою чергу, це дає не-правильну інформацію про чутливість збудників. Таким чином, застосування будь-якого методу дозволяє визначити антибіо-тикограму збудника – спектр його чутливості та антибіотикостійкості. Ус і методи визначення чутливості бактерій до антибіотиків мають свої перева-ги і свої недоліки. То м у постійний контроль за об’єктивністю результатів і дотри-манням правил проведення досліджень сприяють одержанню достовірних даних. У більшості випадків результати визначення антибіотикостійкості in vitro збігаються з клінічними наслідками антибіотикотерапії. Випадки розбіжності по-яснюються рядом причин, серед яких найчастіше зустрічається помилкове трак-тування одержаних лабораторних даних. Причиною таких ситуацій може бути використання при посіві не чистої куль-тури бактерій, а патологічного матеріалу. То м у визначається не чутливість інфек-ційного агента, а мікробної асоціації, в тому числі й сапрофітної флори. Помилки зустрічаються при дослідженні вмісту дванадцятипалої кишки, фекалій, харко-тиння, виділень з ран, сечі тощо. Частина І. Загальна мікробіологія Плазміди роблять бактерії нечутливими до переважної більшості антибіо-тиків, які використовуються у клініках, оскільки кодують синтез ферментів, що руйнують препарати. Одним з найдослідженіших ферментів є бета-лактамаза, яка руйнує антибіотики, що належать до групи бета-лактамів. Розроблено декілька методичних прийомів, що дозволяють швидко визначити її активність. Один з них полягає в тому, що на фільтрувальний папір розміром 2×2 см, що знаходиться в чашці Петрі, капають одну краплю 2 % водного розчину крохмалю. Потім на цей папір наносять петлею агарову культуру мікробів і розтирають її, формуючи бляшку діаметром до 5 мм. На її поверхню наносять робочий йодний розчин пеніциліну. Облік результатів проводять через 10 хв інкубації системи при кімнатній температурі. При наявності бета-лактамази на темно-синьому фоні спостерігаєть-ся яскраво виражена чітка зона просвітління навколо бляшки, що містить агарову культуру мікробів. При негативному результаті зона просвітління відсутня, а краї бляшки нечіткі. Визначення концентрації антибіотиків у біологічних рідинах. При тяж-ких інфекційних процесах, наприклад, сепсисі інколи доводиться визначати кон-центрацію антибіотиків у біологічних рідинах, зокрема, сироватці крові, сечі. Для цього використовують метод серійних розведень (табл. 16) на рідкому середовищі з глюкозою та індикатором Андреде. У двох паралельних рядах готують серійні розведення сироватки і стандарту антибіотика. Потім до кожної пробірки, вклю-чаючи контрольні, додають стандартну суспензію тест-мікробів. Пробірки інку-бують у термостаті при температурі 37 °С протягом 18 год. У тих пробірках, де концентрація антибіотика пригнічує мікроби, середовище залишається безбарв-ним і прозорим. Якщо мікроорганізми проростають, про це свідчить помутніння середовища і поява рожевого забарвлення. Можна використати також фенол-сироваткове середовище з індикатором фено-ловим червоним. У цьому випадку при відсутності росту мікроорганізмів середо-вище залишається червоним, а при наявності ознак росту стає мутним і набуває жовтого кольору. Виходячи із даних таблиці, розчин стандарту пеніциліну затримує ріст тест-мікро-бів у концентрації 0,025 ОД /мл, а досліджувана сироватка – в розведенні 1:8. Отже, вміст пеніциліну в сироватці крові буде дорівнювати 0,2 ОД/мл (0,025 ОД /мл×8). Таблиця 16 Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 919 | Нарушение авторских прав |
