Возбудитель туберкулеза.
Открыт Кохом (1882), принадлежит к порядку Actinomycetales, семейству Mycobacteriaceae, роду Mycobacterium. Микобактерии отличаются ветвистостью, расположением в виде буквы V и разнообразием видов, в том числе патогенных (рис. 66).
Наибольшее значение в патологии сельскохозяйственных животных и человека имеют следующие виды микобактерии; М. tuberculosis — возбудитель туберкулеза человека, М. bovis — возбудитель туберкулеза крупного рогатого скота, М. avium — возбудитель туберкулеза птиц.
Туберкулез характеризуется образованием в различных тканях и органах специфических очагов — бугорков (туберкул), по мере
Рис. 66. Формы мхкобактернй
развития процесса подвергающихся творожистому перерождению. При разных формах течения туберкулеза отмечают повышение температуры, увеличение лимфатических узлов, прогрессирующее истощение организма, а при поражении органов дыхания —кашель.
Бактериологический диагноз. Основан на микроскопии мазков-препаратов из патологического материала, выделении чистой культуры возбудителя туберкулеза и заражении лабораторных животных. Исходя из того что туберкулез протекает преимущественно в скрытой форме (латентно), для своевременного выявления больных применяют аллергический метод диагностики при помощи аллергена туберкулина.
Для бактериологического анализа направляют при жизни животного истечения из носа, бронхиальную слизь, молоко (особенно при увеличении надвыменных лимфоузлов) — не менее 100 мл, фекалий — 30...50, реже мочу — 200 мл. Посмертно или после убоя отправляют кусочки органов с изменениями и бронхиальные, заглоточные, средостенные, предлопаточные, надвыменные лимфоузлы.
При взятии патологического материала необходимо соблюдать правила асептики и профилактические меры, технику безопасности. Материал в лабораторию лучше доставлять свежим. Если нет такой возможности, то лимфоузлы, кусочки органов консервируют в 30...40 %-м водном растворе глицерина. Обсемененность исследуемого материала микобактериями туберкулеза может быть незначительной. Для большей достоверности результатов исследования применяют специальные методы обработки и обогащения, чтобы повысить концентрацию возбудителя в пробах.
Бронхиальную слизь (мокроту) собирают в пробирки с 6%-м раствором серной кислоты, закрывают резиновой пробкой, промывают 5...6 мин встряхиванием, центрифугируют, кислоту отсасывают, к осадку добавляют физраствор, вновь встряхивают и центрифугируют. Так промывают 2...3 раза. Промытый осадок высевают на питательные среды и готовят мазки.
Молоко центрифугируют. Осадок обрабатывают также раствором серной кислоты, промывают физраствором, центрифугируют. Из осадка готовят препараты-мазки и производят посев на питательные среды.
Масло (2...4 г) вносят в стерильную пробирку, заливают горячей водой, закрывают резиновой пробкой, встряхивают 5...10 мин, переворачивают пробирку вверх дном, ставят в штатив и оставляют в прохладном месте. Когда масло застынет, осторожно приоткрывают пробку, жидкость выливают в центрифужные пробирки и далее исследуют как молоко.
Пораженные ткани нарезают мелкими кусочками и растирают в стерильной ступке с 6%-й серной кислотой в соотношении 1: 4, фильтруют через марлю и центрифугируют. Из осадка готовят мазки и производят посевы на питательные среды. Фекалии (50 г) растирают в стерильной ступке с 18 %-м раствором серной кислоты, фильтруют через марлю и центрифугируют, исследуют осадок, как в предыдущих случаях.
Содержимое туберкул дополнительно исследуют микроскопи-рованием препаратов, приготовленных из растертых кусочков творожистой массы очажка между двумя предметными стеклами.
Возбудитель туберкулеза относится к группе кислого-, спирто-шелочеустойчивых бактерий, что обусловлено наличием стеариновых кислот (миколовой, фтионовой) и Других воскоподобных веществ в оболочке микробной клетки. Эти вещества придают микробной клетке гидрофобность, то есть способность отталкивать воду и водные растворы красителей, кислот и щелочей. В связи с этим бактерии туберкулеза трудно воспринимают краску. Для окрашивания этой группы бактерий применяют специальные методы, среди которых наиболее распространенным является метод Циля — Нильсена, при котором микобактерии окрашиваются в розово-красный цвет (цв. рис. XII). Грамположительны. Для микроскопического исследования патологического материала рекомендован также люминесцентный метод.
Возбудитель туберкулеза палочковидной формы, длиной 1,5...5мкм и шириной 0,5 мкм. М. tuberculosis — тонкая слегка изогнутая палочка, М. bovis — короткая и толстая, М. avium — мельче остальных видов, обладает полиморфизмом. Микобактерии туберкулеза неподвижные, не образуют капсулу и спору. В мазках из исследуемого материала располагаются одиночно и в виде небольших скоплений. В мазках из культур помимо одиночных бактерий встречаются длинные нити с разветвлениями. Часто проявляются неравномерность в окрашивании, наличие в цитоплазме зернистости (грамположительные некислотоустойчивые «зерна Муха»), Микобактерии — аэробы. Растут только на специальных средах с добавлением глицерина.
Выделение чистой культуры. Для выделения возбудителя из патологического материала используют элективные (избирательные) среды — яично-крахмальные, картофельные с глицерином и краской (малахитовая зелень) для задержки роста посторонних микроорганизмов.
Для культивирования используют также синтетические среды, например Финна, Дорсе и Моделя.
Среда Дорсе представляет собой тщательно растертое яйцо с 10 мл раствора Рингера. Затем эту смесь взбалтывают в сосуде с бусами и разливают по пробиркам, стерилизуют дробно: 3 сут при 75 "С по 1 ч.
Среда Моделя: двухосновный фосфат калия — 5 г, цитрат аммония — 10 г, сульфат магния — 0,5 г, сульфат железа — 0,05 г, глицерин — 50 мл, дистиллированная вода — 1 л, рН среды 7,2. Стерилизуют 20 мин при 115°С.
Культивировать можно и на обычном картофеле, пропитанном 3...4 %-м глицерином, в глицериновом МПБ и на глицериновом МПА. Срок инкубации при 37 °С от 3...4 нед до 2...3 мес. Рост учитывают каждые 5...7сут. Отдельные виды микобактерий могут проявить рост через 2...4 нед.
Культуральные свойства. М. tuberculosis в глицериновом бульоне на поверхности среды растут в виде толстой складчатой пленки с широким пристеночным кольцом. На плотных средах рост обильный, колонии сухие бородавчатые или сморщенные, иногда в виде узелков цвета слоновой кости (цв. рис. XIII). М. bovis в бульоне образует пленку нежную, иногда сетчатую, не покрывающую всей поверхности среды. На плотных средах рост скудный, колонии сухие, мелкие, зернистые, серовато-белого цвета. М. avium в жидких средах образует сначала сухую, затем ослизняющуюся пленку по всей поверхности среды. На плотных средах влажный и слизистый налет. Колонии серовато-белые или желтоватого цвета с пуговицеобразным круглым возвышением, иногда кратерообразным углублением. Растет быстрее, чем остальные виды микобактерий.
При исследовании масла следует учитывать возможность наличия кислотоустойчивых сапрофитов (М. phlei и др.), которые растут на питательных средах очень быстро (4...7 сут) по сравнению с патогенными микобактериями.
Чистую культуру микобактерий определяют на видовую принадлежность. Одним из распространенных методов дифференциации является культивирование в глицериновом бульоне с 5 % желчи. Каждый вид микобактерий растет в присутствии желчи соответствующего вида животного: М. avium —в присутствии только птичьей желчи, М. bovis — с добавлением желчи крупного рогатого скота. Наличие миколовой кислоты в клетках способствует тому, что патогенные штаммы растут на питательных средах в виде косичек, хорд.
Биопробу используют для определения патогенности и дифференциации видов бактерий туберкулеза. Заражают морских свинок, кроликов и при необходимости кур, предварительно проверенных аллергическим методом для исключения спонтанного туберкулеза. Для заражения применяют выделенную культуру или присланный в лабораторию материал. Последний предварительно обрабатывают по Гону серной кислотой, как указывалось выше, растирая в стерильной ступке. Затем к осадку после центрифугирования добавляют 15%-й раствор гидрокарбоната натрия (двууглекислой соды), оставляют на 10...15 мин и вновь центрифугируют 5 мин. Образовавшийся осадок дважды промывают стерильным физиологическим раствором NaCl с последующим центрифугированием, а затем осадок вновь эмульгируют в физиологическом растворе, отстаивают 5... 10 мин. Надосадочную жидкость вводят в дозе 1...2мл: морским свинкам в паховую область, кроликам — внутривенно.
У морских свинок в положительных случаях через 2...3нед на месте введения образуется уплотнение, затем язва с одновременным увеличением регионарных лимфоузлов. Далее этим свинкам через 2...3 нед подкожно вводят туберкулин, что приводит к бурной генерализации процесса и гибели животных. При вскрытии из типичных туберкулов готовят мазки и делают посевы. М. bovis вызывает генерализованный процесс туберкулеза у кроликов и морских свинок. М. tuberculosis патогенны лишь для морских свинок, вызывая заболевание в период от 3 нед до 3 мес после заражения. М. avium, как правило, обусловливает у кроликов септический процесс без образования специфических бугорков и приводит к быстрой гибели животных (особенно при внутривенном заражении).
Дифференциация. Для дифференциации отдельных видов микобактерий лучше заражать животных суспензией выращенных культур. Если у выделенных культур слабая вирулентность и атипичный рост, то микобактерий необходимо дифференцировать от кислотоустойчивых сапрофитов. Для этого используют следующие тесты:
1. Определение каталазной активности. В пробирку с вырос шей культурой на яичной среде вносят 50%-й раствор пергидро ля, чтобы вся поверхность среды с культурой была покрыта. С момента появления пузырьков газа учитывают результат — стол бик пены измеряют в миллиметрах (мм). Каталазной активнос тью обладают все кислотоустойчивые бактерии, но у сапрофитов она интенсивнее.
2. Определение лекарственной устойчивости. Осуществляют с культурами, выращенными на питательных средах с добавлением различных концентраций туберкулостатических препаратов (стрептомицин, ПАСК и др.). Вирулентные штаммы М. tuberculosis, M. bovis, как правило, чувствительны к действию этих препаратов. Между тем атипичные штаммы, кислотоустойчивые сапрофиты и М. avium обладают устойчивостью в отношении ан титуберкулезных лечебных препаратов, особенно к фтивазиду и ПАСК (парааминосалициловая кислота).
Аллергический метод используют в хозяйстве как метод массовой диагностики скрытых форм туберкулезного процесса. С этой целью применяют специфические препараты — туберкулин для крупного рогатого скота и отдельно для птиц.
Возбудитель паратуберкулезвого энтерита крупного рогатого скота (Mycobacterium paratubercutosis). Вызывает заболевание преимущественно у крупного рогатого скота, реже у овец, верблюдов и очень редко у коз и оленей. Паратуберкулез — хроническая инфекционная болезнь, характеризующаяся образованием отечно-воспалительных складок слизистого и подслизистого слоя пораженного участка кишечной стенки под действием локализованного здесь возбудителя. Характерные клинические признаки болезни — профузный понос и прогрессирующее истощение.
Лабораторная диагностика. При жизни животного посылают фекалии с комочками слизи и примесью крови, со-скобы со слизистой оболочки прямой кишки; посмертно (или при убое) исследуют пораженные участки кишечника, отрезок подвздошной кишки, перевязанный с двух сторон, мезентериальные лимфатические узлы. Материал берут с соблюдением правил асептики, консервируют в 30%-м растворе глицерина. Для гистологического исследования консервируют в 10%-м растворе формалина.
Бактериологический анализ. Включает в себя микроскопию мазков из патологического материала и выделение чистой культуры возбудителя паратуберкулеза. Основным ориентиром служит результат микроскопирования препаратов, так как выделение чистой культуры возбудителя сопряжено с большими трудностями. Биологическую пробу на паратуберкулез не ставят, т. к. лабораторные животные не восприимчивы. Можно использовать телят.
Подготовка материала. Учитывая загрязненность материала посторонней микрофлорой, его предварительно обрабатывают с целью очистки и концентрации возбудителя, как и при диагностике туберкулеза, а также применяют способы Венота и Моро или метод флотации.
Метод Венота и Моро: 2...4 г фекалий растирают в стерильной ступке, добавляют 25%-й раствор NaCl до жидкой консистенции и фильтруют через двойной слой марли. Фильтрат сливают в центрифужные пробирки, добавляют по 1 мл петролейного эфира (можно бензин или лигроин), взбалтывают, центрифугируют 15...20 мин при 3000 мин-'. Мазки готовят из нижней части надо-садочного слоя жидкости.
Микроскопия. M.paratuberculosis— мелкая палочка длиной 0,5... 1,5 мкм и шириной 0,2...0,5 мкм, неподвижная, споры и капсулы не образует, кислотоустойчивая, грамположительная. В препаратах из патологического материала располагается кучками, гнездами, редко одиночно или по 2...4 клетки. Отмечается поли-морфность: палочки могут иметь расширение, приобретая контуры бутылки, ручной гранаты, бесструктурных глыбок, мелких кокков. В мазках из культуры палочки длиннее, стройнее, скученность меньшая, в некоторых видна зернистость.
В связи с тем что выделение возбудителя паратуберкулеза с фекалиями происходит периодически, при сомнительном или отрицательном результате микроскопии исследование повторяют.
Кроме обычной световой используют люминесцентную микроскопию препаратов-отпечатков из патологического материала или полученной чистой культуры, используя специфические люми-несцирующие сыворотки.
Выделение чистой культуры. Осуществляют посевом на специальные питательные среды, так как на обычных средах возбудитель паратуберкулеза не растет. Активный рост наблюдают при добавлении к питательным средам вытяжки из убитых бактерий туберкулеза или кислотоустойчивых сапрофитов. М. phlei выращивают на среде Данкинса: в 4%-м глицериновом бульоне растирают 10 мл глицерина и 10 мл печеночного экстракта, кипятят, добавляют три свежих яйца, хорошо перемешивают, вносят спиртовой раствор генцианвиолета (2,5 % к общему объему среды), фильтруют, разливают в пробирки, скашивают и стерилизуют в аппарате для свертывания сывороток дробно в течение 3 сут подряд при 80°С по 1 ч.
Патологический материал. Предварительно обрабатывают 5%-м раствором серной кислоты, промывают физиологическим раствором NaCl, растирают в ступке и высевают на среды. Посевы помешают в термостат при 38 °С; через 2 сут пробирки парафинируют. Учет производят с помощью лупы через 15 сут, а затем каждые 5 сут. Первичный рост на казеиновой среде наблюдают к 18...20 сут при сильной обсемененности засеянной ткани; при слабой обсемененности — в более поздние сроки. На плотных элективных средах колонии плоские, сухие, серовато-беловатые, с неровными краями. По мере роста края приобретают бугристость, не отличаясь от колоний других микобактерий. В жидких средах (МПБ с глицерином, синтетических средах) на поверхности образуется нежная беловатая пленка, которая в силу собственной тяжести опускается на дно.
Дифференциация. Возбудитель паратуберкулезного энтерита дифференцируют от возбудителя туберкулеза по следующим тестам: 1) культивирование микобактерий паратуберкулеза возможно только на средах с добавлением «фактора роста»; 2) лабораторные животные невосприимчивы к возбудителю паратуберкулеза.
Серологическая диагностика. Пробы сывороток крови исследуют в РСК по общепринятой методике (с паратуберку-лезным антигеном — метаноловым экстрактом микробной массы М.paraluberculosis); реакция неспецифична. Помимо названных методов диагностики паратуберкулеза, широко используют аллергическую диагностику в соответствии с действующей инструкцией.
Биопрепараты. Вакцина БЦЖ (BCG): представляет собой живую лиофильно высушенную культуру вакцинного штамма туберкулезных микобактерий бычьего типа. Вакцинный штамм BCG (Bacillus Calmette — Guerin) был получен в 1924 г. французскими учеными Кальметтом и Гереном путем длительного культивирования (в течение 18 лет) вирулентного штамма М. bovis на картофельно-гли-цериновой среде с добавлением бычьей желчи. Для приготовления противотуберкулезной вакцины штамм БЦЖ выращивают на специальных средах в течение 20 сут. В ветеринарной практике вакцину БЦЖ используют в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах для профилактики туберкулеза у крупного рогатого скота.
Сухой очищенный туберкулин ППД для млекопитающих готовят из культуры микобактерий, которую выращивают в течение двух месяцев, а затем стерилизуют авто планированием. Белок из культуральной жидкости осаждают трихлоруксусной кислотой. Преципитат белка, отделенный центрифугированием, растворяют в воде и вновь осаждают сульфатом аммония. Белок — это основная фракция туберкулина ППД, содержание его составляет 73,4...90 %. Кроме того, в состав препарата входят полисахариды, липиды и нуклеиновые кислоты.
Альттуберкулин (АТК)для млекопитающих: стерильный фильтрат культуры микобактерий, выращенных в течение двух месяцев на мясогидролизатном картофельно-глицериновом бульоне. Бульон концентрируют, выпаривая до 1/10 первоначального объема, и затем добавляют 20 % экстракта бактериальной массы микобактерий.
Туберкулин ППД для птиц: готовят, используя пять штаммов М. avium. Выделение белка из культуральной жидкости и приготовление препарата проводят, как при получении АТК.
Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 885 | Нарушение авторских прав
|