Тема 24. ПАТОГЕННЫЕ СПИРИЛЛЫ
Возбудитель кампилобактериоза. Это бактерии семейства Spirillaceae, рода Campylobacter. Основные виды: C.fetus (подвиды С. fetus venerealis и C.fetus sb.fetus), C.jejuni, С. sputorum (подвиды С. sputorum sputorum, С. sputorum bubulus, С sputorum faecalis) и непатогенный С. coli. C.fetus sb. fetus вызывает аборты у овец, крупного рогатого скота. C.fetus sb. veneralis — патогенен для крупного рогатого скота. C.jejuni вызывает аборты у овец, энтериты у телят, ягнят и других животных. С. mucosalis патогенен для свиней; выделяют при признаках некротического энтерита и локального илеита.
Бактериологическое исследование. Включает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале методом световой микроскопии, выделение чистой культуры посевом на питательные среды и идентификацию возбудителя по культураль-но-морфологическим, ферментативным, серологическим свойствам.
В лабораторию направляют абортированный плод целиком с плодными оболочками или от крупных плодов голову, желудок, легкие, печень; у абортировавших животных — плаценту, слизь из шейки матки, взятую стерильно в первые З...4сут после аборта или в период охоты; от быков-производителей — препуциальную слизь и секрет придаточных половых желез; от убитых с диагностической целью животных — матку, влагалище, лимфоузлы тазовой области.
Микроскопия. Представители рода Campyhbacter — грам-отрицательные полиморфные тонкие палочки, изогнутые в виде «крыла чайки», запятой, спирали с одним или несколькими завитками, или S-образные. Средние размеры (0,5...8) х (0,2...0,8) мкм. Подвижны за счет одного полярного жгутика на одном или обоих концах клетки; движение винтообразное. Спор и капсул не образуют.
В мазках от животных, подвергавшихся лечению, располагаются в виде длинных спирилл, малоизвитых нитей и мелких кокко-видных форм.
Культурально-биохимические свойства. Возбудитель — микроаэрофил; температурный оптимум роста 37...38 "С. Для получения культуры кампилобактерий используют полужидкие и плотные питательные среды: плотный 2...3 %-й МППА и полужидкий 0,2 %-й мясопеченочный пептонный агар (ПЖА), среду Китта—Тароцци без масла, агар Мартена, сафрани-но-железо-новобиоциновую (СЖН) среду. Для обогащения в питательные среды добавляют 5... 10 % дефибринированной крови крупного рогатого скота, овец, кроликов или сыворотку крови лошади. Культивируют в течение 6...10сут в микроаэрофильных условиях при замене 10...15% воздуха оксидом углерода. Контаминирован-ный материал высевают на среду СЖН: полужидкий агар — 0,5 мл, 2 %-й раствор сульфата железа — 5 мл, 0,5 %-й водный раствор сафранина Т —5 мл и 0,2%-й водный раствор новобиоцина — 5 мл. Среду фильтруют через бумажный фильтр, разливают в пробирки и автоклавируют 25 мин при 115 °С. Готовая к использованию среда должна быть розового цвета; рН 6,8. При культивировании на данной среде кампилобактерий ее цвет не изменяется, другой микрофлоры — приобретает ярко-желтую окраску.
Каждую пробу высевают, растирая шпателем по поверхности среды, в нескольких чашках Петри. Выросшие колонии пересевают на полужидкий кровяной, сывороточный агар или среду Китта — Тароцци для получения чистой культуры.
При первичном выделении на плотной среде кампилобактерий образуют через 3...4 сут колонии (гладкие, бесцветные, диаметром мм или шероховатые, непрозрачные, белые или кремовые до мм в диаметре, или плоские, серые или светло-коричневые с неровными краями); редко в виде тонкого налета. На кровяном агаре гемолиз отсутствует. При росте на сывороточном бульоне дают слабое помутнение, иногда с образованием незначительного рыхлого осадка. На полужидком агаре растут в виде серовато-голубого диска около поверхности среды.
У выделенных культур кампилобактерий изучают ферментативную активность, ростовые потребности и на основании полученных данных идентифицируют их на уровне вида, подвида, биовара.
Серологическая идентификация. Для серодиагностики кампилобактерий выпускают агглютинирующие и лю-минесцирующие сыворотки против. С. fetus subsp. fetus (первый тип), С. fetus subsp. venerealis (второй тип), С. spulorum subsp. bubulus (третий тип).
Для ориентировочной идентификации выделенных культур ставят РА на стекле, используя указанные сыворотки, разведенные 1:50.
Для окончательной серологической идентификации кампилобактерий ставят пробирочную РА. Для этого готовят последовательные разведения каждой из трех моноспецифических сывороток в 3 %-м растворе хлорида натрия, содержащем 0,3 % формалина, — 1:25, 1:50, 1: 100,!: 200. Затем в каждую пробирку с указанными разведениями моноспецифических сывороток добавляют по 0,5 мл исследуемой суспензии вибрионов концентрацией 1 -109. После внесения компонентов пробирки тшательно встряхивают и помещают в термостат (37 °С) до следующего дня. Затем их выдерживают 3...4 ч при комнатной температуре и учитывают результаты реакции.
При положительной реакции с моноспецифической сывороткой одного типа и отрицательной с моноспецифическими сыворотками остальных двух типов исследуемый штамм относят к тому типу, с которым получен положительный результат.
При получении положительной реакции с двумя моноспецифическими сыворотками (что может быть при выделении атипичных или диссоциированных штаммов) опыт повторяют с обеими моноспецифическими сыворотками, агглютинировавшими исследуемую суспензию вибрионов, применяя более высокие разведения, чтобы определить титр каждой сыворотки. Типовую принадлежность исследуемого штамма устанавливают по той моноспецифической сыворотке, которая агглютинирует микробную суспензию в более высоком титре.
Для идентификации возбудителей кампилобактериоза в реакции иммунофлуоресценции используют как чистые, так и смешанные культуры, выращенные на общепринятых питательных средах.
Б и о и р о б а. Нативным материалом или выделенной культурой заражают беременных морских свинок внутрибрюшинно или во влагалище с последующим исследованием абортированных плодов. Если в течение 10...12 сут аборт отсутствует, то морских свинок убивают и исследуют содержимое полости матки и плоды. При необходимости биопробу ставят на беременных телках и овцах, заражая их подкожно или перорально. Животные абортируют, а при отсутствии аборта их убивают с диагностической целью.
Серологическая диагностика. Основана у коров на результатах реакции агглютинации с вагинальной слизью (РАВС), а у овец — РА с сывороткой крови.
Слизь берут марлевым тампоном, который помещают в пробирку с 5 мл формалинизированного 3%-го раствора хлорида натрия. Выдерживают 12...14 ч. Тампон отжимают, жидкость центрифугируют при 2500...3000 мин~' в течение 30 мин.
После центрифугирования реакцию ставят с экстрактом вагинальной слизи в четырех двукратных разведениях. Для приготовления кампилобактериозного антигена исходную концентрированную суспензию бактерий разводят физиологическим раствором, содержащим 0,3 % формалина, в соотношении 1: 10.
Наряду с исследуемыми пробами материала ставят контроли антигена: 1) контроль антигена (проверка самоагглютинации) — в пробирку наливают 0,5 мл антигена в рабочем разведении и добавляют 0,5 мл 3%-го формалинизированного раствора хлорида натрия; 2) контроль активности антигена; в каждую пробирку с разведенной агглютинирующей кампилобактериозной сывороткой первого типа добавляют по 0,5 мл антигена; 3) контроль специфичности антигена: в две пробирки, содержащие по 0,5 мл нормальной сыворотки в разведениях 1: 100 и 1: 200, добавляют по 0,5 мл антигена. Все пробирки встряхивают и далее поступают с ними так же, как с опытными.
Вначале учитывают результаты контроля антигена. Отрицательная реакция в 1-м и 3-м контролях при положительной во 2-м свидетельствует о правильности постановки реакции.
Учет результатов: 1) положительная —реакция хорошо выражена (на три-четыре креста) во всех пробирках или только в 1-й и 2-й; 2) сомнительная —агглютинация на один-два креста в 1-й и во 2-й пробирках; 3) отрицательная — отсутствие агглютинации во всех пробирках.
У больных овец для исследования берут сыворотку крови, разводят ее в 100, 200 и 400 раз. Результат считают положительным, если исследуемая сыворотка дает реакцию агглютинации в разведении 1: 200 и выше на четыре или три креста, сомнительным — на четыре или три креста в разведении 1: 100 либо на два или один крест в разведении 1: 200, отрицательным — если агглютинация отсутствует или ее оценивают не выше чем на два или один крест в разведении 1: 100. Сыворотку овец, вакцинированных против кампилобактериоза, серологически не исследуют.
Кроме РА сыворотку животных можно исследовать в РСК, реакции иммунофлуоресценции или реакции иммунной сорбции антител, меченных ферментами. Для выявления антител в РНГА разработаны экспериментальные партии диагностикумов, которые используют для диагностики кампилобактериозов животных и человека.
Биопрепараты. И нактивиро ванная эмульсированная вакцина против кампилобактериоза овец.
Кампилобактериозные агглютинирующие сыворотки.
Кампилобактериозный антиген представляет собой инактиви-рованную 0,3%-м раствором формалина суспензию кампилобак-терий.
Возбудитель лептоспироза. Принадлежит к порядку Spirochaetales, семейству Spirochaetaceae, роду Leptospira. Патогенные лептоспиры составляют 25 серологических групп, включающих 124 серологических варианта, из них от сельскохозяйственных животных выделено семь— L. icterohaemotrfmgiae, L.pomona, L. tarassowi, L grippotyphosa, L. hebdomadis, L canicola, L. cazackstanika.
Лептоспироз — инфекционная болезнь разных видов животных и человека. Наиболее часто болезнь протекает с кратковременной лихорадкой в острой и подострой форме; гемоглобинурией {особенно у телят), желтушностью слизистых оболочек. У коров и свиноматок возможны аборты. Переболевшие животные длительное время остаются лептоспироносителями.
Бактериологическое исследование. В лабораторию направляют при жизни животного мочу, кровь в период лихорадки; посмертно — труп или кусочки паренхиматозных органов, почку, транссудат из грудной и брюшной полостей, пери-кардиальную жидкость, мочевой пузырь с содержимым, абортированный плод или органы плода. Жидкие субстраты отсасывают в стерильные пробирки. Патологический материал доставляют с нарочным в опечатанном ящике не позднее 6 ч после гибели животного в летнее время и 12 ч зимой. Воду (до 2 л) на наличие лептос-пир направляют в лабораторию в бутылях (колбах).
Из патологического материала готовят нативные неокрашенные препараты для микроскопирования методом «раздавленной капли» в темном поле зрения. Лептоспиры плохо воспринимают анилиновые краски. По Граму окрашиваются отрицательно, по методу Романовского — Гимза через 48 ч — в розово-фиолетовый цвет, по методу Киктенко — в красно-фиолетовый цвет (на бесцветном фоне). Метод Киктенко заключается в том, что на нефиксированный препарат наносят специальный раствор (0,2 г танина, 2 мл формалина, 5 мл 4 %-го спиртового раствора йода, 100 мл дистиллированной воды). Выдерживают 1 мин, сливают и наносят другой краситель (1 г генциан виол ета в 100 мл 25%-го этилового спирта) на 50 с при подогревании. После этого препарат промывают, высушивают и микроскоп и руют под иммерсией.
Морфология. Лептоспиры представляют собой тонкие длинные спиралеподобные микроорганизмы длиной 10... 15 мкм и шириной 0,1—0,2 мкм, количество спиралей (завитков) 10... 12 и более. Споры и капсулы не образуют. На концах лептоспир имеются утолщения. Движение маятникообразное. Подвижность сохраняется не более 2 ч с момента взятия крови или мочи.
Выделение чистой культуры. Производят посевы патологического материала на полусинтетическую среду ГНКИ, состоящую из овечьего альбумина, воды и компалона (фактора роста), или на среды Любашенко и Терских, в основу которых взят фосфатно-буферный раствор на 5 % кроличьей сыворотки и 1 % пептона, дистиллированная вода; рН среды 7,2...7,4. Лептоспиры — факультативные аэробы. Оптимальная температура роста культивирования 28...30 "С. Культивирование составляет 7...20сут. Среда остается прозрачной, рост культуры определяют микроскопированием препаратов из нее. Если макроскопически виден рост (помутнение среды и осадок) — культура загрязнена.
Патогенность. Определяют биопробой: выделенной культурой заражают морских свинок или золотистых хомяков, крольчат 3...5-недельного возраста. Культуру или взвесь исследуемого растертого материала инъецируют подкожно или внутрибрю-шинно хомякам в дозе до 1 мл, крольчатам — 2...3 мл (по два животных на каждую пробу). Одного убивают через 4...5 сут, второго—спустя 14...1бсут, вскрывают и проводят бактериологическое исследование.
Лептоспиры продуцируют ферменты (плазмокоагулазу, липазу и лецитиназу) и экзотоксины (гемотоксин, некротоксин), а также эндотоксин.
В культуре ткани лептоспиры проявляют цитопатогенное действие.
Серологические методы. Чаще используют для прижизненной диагностики лептоспироза. Кровь от животных допускается исследовать лишь через два месяца после их вакцинации. Самым распространенным методом является реакция микро-агглютинации (РМА) со свежей, высушенной на фильтровальной бумаге или консервированной 0,5 %-м раствором фенола сывороткой. Сначала готовят разведения сыворотки — 1: 50, 1:100, 1: 200, 1: 400 (при необходимости и больше), затем добавляют антиген — живые культуры лептоспир.
Удобно ставить реакцию в следующей модификации: из каждого разведения сыворотки (начиная с большего) по 0,1 мл вносят в 6...13 лунок пластины для серологических реакций или в пробирки Флоринского в зависимости от количества имеющихся в лаборатории антигенов — живых культур диагностических штаммов лептоспир. Каждый антиген — 5,..15-суточная культура лептоспир с концентрацией 70...100 микробных тел в поле зрения микроскопа (предварительная проверка) — вносят по 0,1 мл в четыре лунки (пробирки) с разными разведениями сыворотки по 0,1 мл. Электролитной средой служит 0,85 %-й раствор хлорида натрия. Антигены с сывороткой встряхивают, помещают в термостат на 1 ч при 30 °С. Контрол — культура лептоспир с физиологическим раствором (также по 0,1 мл). Используют иммунно-ферментный анализ.
Для учета реакции используют микроскопию: из каждой пробирки (или лунки) готовят препарат «раздавленная капля» и мик-роскопируют его в темном поле микроскопа при увеличении 20 х 10. При наличии гомологичных антигену антител в сыворотке происходит агглютинация— образуются агглютинаты склеенных лептоспир в виде паучков или пучков, сохраняющих подвижность на свободных концах. Результат РМА оценивают в крестах: «++++» — агглютинация 100 % лептоспир, «+++» — 75 %, «++» — 50%, «+» — 25 % лептоспор; «—» — агглютинация отсутствует. В небольших разведениях сыворотки наблюдают набухание и неподвижность, зернистость и лизис лептоспир. Положительная реакция признается с оценкой в четыре и три креста, два креста — результат сомнительный.
Помимо РМА ставят обычные РА, РСК и РИФ по общепринятым методикам.
Биопрепараты. Депонированная поливалентная вакцина против лептоспироза сельскохозяйственных и промысловых животных: готовят из 7...10-суточной культуры лептоспир, консервированных 5%-м раствором карболовой кислоты.
Поливалентная вакцина против лептоспироза сельскохозяйственных и промысловых животных: получают методом гипериммунизации волов-продуцентов. Антигены для гипериммунизации готовят из производственных штаммов 6 серогрупп.
Антигены для диагностики лептоспироза в реакции макроагглютинации: готовят из эталонных штаммов лептоспир. Выращенные культуры инактивируют формалином, концентрируют, расфасовывают по ампулам и подвергают сублимационному высушиванию.
Групповые агглютинирующие лептоспирозные сыворотки предназначены для определения серогрупповой принадлежности лептоспир, выделенных из патологического материала, а также лептоспир, используемых в качестве антигенов в реакции микроагглютинации при серологической диагностике лептоспироза.
Возбудитель дизентерии свиней (Serpulina hyodysenteriae). Принадлежит к роду Serpulina.
Бактериологическое исследование. Включает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале методом световой микроскопии, а также выделение чистой культуры посевом на питательные среды и идентификацию возбудителя по куль-турально-морфологическим и ферментативным свойствам.
Для прижизненной диагностики в лабораторию направляют фекалии, для посмертной — слизистую оболочку большой ободочной кишки, которую соскабливают после удаления из кишечника содержимого и промывания водой. От трупов материал берут не позднее чем через 2 ч после гибели животного: материал должен быть исследован в течение 2...4 ч, а при хранении на холоде — 6...8ч.
Микроскопия. Поскольку культивирование возбудителя весьма трудоемко, микроскопическое исследование — это основной метод диагностики, доступный практическим лабораториям. Поступивший материал исследуют методом темнопольной, фазо-во-контрастной или обычной световой микроскопии.
При темнопольной микроскопии препарат «раздавленная капля» исследуют в водной иммерсии с объективом х 40 и окулярами х7 или х 10. Возбудитель в этом случае виден как спиралевидная клетка с 3...I2 правильными витками размером (7...9) х х (0,3...0,4) мкм, движущаяся змеевидно-поступательно. При температуре 22 °С наблюдают изгибание клетки и скользящее движение, а при 37...42 °С —поступательное. У большинства больных дизентерией свиней в препарате «раздавленная капля» в одном поле зрения обнаруживают 5... 10 спирохет и более. В препаратах, окрашенных по Граму, видны грамотрицательные извитые клетки со строением, типичным для спирохет. Клетки возбудителя хорошо окрашиваются по Романовскому—Гимза, фуксином Пфейф-фера. Сходные по морфологии с Serpulina hyodysenteriae вибрионы, обитающие в кишечнике, отличаются тем, что толщина их клетки в 2...4 раза больше, с тупыми концами, движение вращательное вокруг длинной оси.
Культурально-биохимические свойства. Возбудитель —строгий анаэроб. Температурный оптимум роста 36...38°С (при 25...30°С не растет), рН 7,0...7,2. Для первичного выделения используют селективные среды. Например, кровяной агар со спектомицином готовят следующим образом: к перевару Хоттингера добавляют 0,001 % резазурина, 0,5 % хлорида натрия, 0,25 % глюкозы, 1 % пептона, 2 % агара, кипятят, через среду пропускают азот или диоксид углерода в течение 10...15 мин, устанавливают рН 7,0...7,2, вносят 0,05 % гидрохлорида цистеина. Среду автоклавируют при 110°С в течение 30 мин, охлаждают до 40...45 "С, пропуская при этом через среду стерильный газ без кислорода, после чего вносят 10 % дефибринированной крови барана (или крупного рогатого скота) и 400 мкг/мл спектомицина. Среду разливают в атмосфере оксида углерода. На кровяном агаре через 48...96 ч инкубирования при 38 °С вырастают плоские просвечивающие колонии диаметром 0,5...3 мм с зоной р-гемолиза.
Культивируют также в жидкой или полужидкой среде, содержащей сердечно-мозговую вытяжку и 10 % эмбриональной телячьей или кроличьей сыворотки. На кровяном агаре через 48—96 ч инкубирования при 38 °С вырастают плоские просвечивающие колонии диаметром 0,5...3мм с зоной р-гемолиза. В полужидком сывороточном агаре возбудитель растет в виде беловатого диффузного облачка ближе к поверхности среды.
После изучения морфологических и культуральных свойств у выделенных бактерий исследуют ферментативную активность. Патогенные для свиней культуры гидролизуют эскулин, не ферментируют фруктозу, утилизируют пируват. При сбраживании глюкозы образуют водород, диоксид углерода, ацетат; нитраты не восстанавливают; растут на средах, содержащих 6,5 % хлорида натрия, но не растут на средах с 1 % глицина.
Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 1041 | Нарушение авторских прав
|