АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Тест агрегации с ристоцетином

Принцип метода - оценка агрегации тромбоцитов при добавлении раствора ристоцетина (препарат стимулирует агрегацию только в присутствии фактора Виллебранда).

Реактивы и оборудование. Растворы ристоцетина, приготовленные на физиологическом растворе (рН 7,4): 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 1,9; 2,0 мг/мл; микроскоп с фазово-контрастным устройством; предметные стекла; секундомеры.

Ход определения.

Венозную кровь в силиконированной пробирке стабилизируют 3,8% раствором основного цитрата натрия в соотношении 4:1 (как правило, берут 0,8 мл крови и 0,2 мл 3,8% раствора цитрата). Затем кровь центрифугируют при комнатной температуре 10 минут при 1000 об/мин для получения плазмы, богатой тромбоцитами.

На предметном стекле стеклянной палочкой смешивают поровну исследуемую плазму с каждым из приготовленных разведений ристоцетина (по 0,02 или 0,01 мл). Стекло покачивают 2 минуты и под микроскопом (окуляр х10, объектив х15 или х20) определяют минимальную дозу препарата, которая вызывает отчетливую агрегацию тромбоцитов. Ее выражают конечной концентрацией препарата в реакционной смеси, равной половине концентрации использованного разведения, т.к. ристоцетин в 2 раза разводится плазмой. Например, если агрегация кровяных пластинок появилась после применения ристоцетин в концентрации 1,2 мг/мл, то минимальная агрегирующая доза равна 0,6 мг/мл.

Практическое значение. Минимальная агрегирующая доза ристоцетина у здоровых людей находится в пределах 0,6 мг/мл; у страдающих болезнью Виллебранда в пределах 0,8 мг/мл.

Фактор Виллебранда представляет собой гликопротеид, вырабатывающийся эндотелиальными клетками сосудов и мегакариоцитами. Он содержится в плазме (7 - 10 мкг/мл), альфа-гранулах тромбоцитов и в субэндотелии. Фактор взаимодействует с тромбоцитами посредством двух мембранных тромбоцитарных рецепторов (гликопротеиды 1а и 1в) и является кофактором агрегации и адгезии кровяных пластинок. Нарушение функции тромбоцитарных рецепторов и снижение концентрации фактора Виллебранда или изменение его функциональной активности ведут к нарушению адгезивности тромбоцитов к сосудистой стенке. Кроме того, фактор Виллебранда действует в комплексе с плазменным фактором VIII свертывания крови и определяет его антигенную активность.

Установлена линейная связь между степенью ристоцетиновой агрегации и количеством фактора Виллебранда. Она и служит основой для количественной оценки этого фактора по минимальной ристоцетиновой агрегации. На первом этапе обследования больного для выявления болезни Виллебранда (наследственный дефицит или молекулярные аномалии фактора) можно использовать метод ристоцетиновой агрегации в богатой тромбоцитами плазме больного без выделения тромбоцитной суспензии. Болезнь Бернара-Сулье, при которой на мембране тромбоцита нет 1в рецептора к фактору Виллебранда, также дает нарушение ристоцетиновой агрегации, при этом дифференциальная диагностика проводится на основании обнаружения в мазке гигантских тромбоцитов и определении нормальной активности фактора VIII.

Примечания. Разведения ристоцетина хранят при +4⁰С 2 недели. Агрегацию можно учитывать и под обычным микроскопом. Средняя минимальная агрегирующая доза ристоцетина колеблется в пределах от 0,5 до 0,8 мг/мл. Поэтому, прежде чем начать исследование с другой серией ристоцетина, необходимо определить эту дозу на плазме 2 - 3 здоровых людей. Отклонение от нее у отдельных здоровых людей не превышает 0,1 мг/мл.

Макроскопическим методом может быть исследована также агрегация под действием коллагена (в конечных концентрациях 20-50 мкг/мл) и бычьего фибриногена (в конечной концентрации 1-1,5 мг/мл). В случае нарушения реакции высвобождения тромбоцитов агрегация не развивается при перемешивании с коллагеном; болезнь Бернара-Сулье распознается по отсутствию одновременно ристомицин- и фибриногензависимой агрегации.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 997 | Нарушение авторских прав