АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Количественное определение фактора Виллебранда (по Evans и Osten в модификации Б.Ф.Архипова, Л.З. Баркагана Л.В. Марамзиной (1982 г.)

Принцип: Определяется влияние содержащегося в плазме обследуемого фактора Виллебранда (ФВ) на агглютинацию под воздействием ристомицина отмытых и формалинизированных донорских тромбоцитов. В основе метода лежит установленный факт, что тромбоциты, обработанные раствором формалина, сохраняют способность к ристомицинагглютинации в присутствии фактора Виллебранда, но не подвержены ни спонтанной агрегации, ни агрегации под влиянием физиологических индукторов процесса (АДФ, адреналина, тромбина и др.). В предлагаемой модификации вместо венозной крови используется 0,2 мл крови, взятой после прокола кожи пальца. Результаты теста оцениваются визуально по времени появления первых агрегатов.

Реактивы: 1. 3,8% раствор цитрата натрия; 2. 0,2% раствор ЭДТА в 0,9% растворе хлорида натрия (рН 6,4); 3. Фиксирующий раствор (2% раствор формалина в 0,9 % растворе хлорида натрия); 4. Отмывочный раствор (смесь одного объема 3,8% цитрата натрия и 5 объемов 0,9% раствора хлорида натрия, рН 6,4); 5. Суспензирующий раствор (готовится так же, как и отмывочный, но рН доводится до 7,4); 6. Раствор ристомицина (6 мг ристомицина растворяют в 1 мл изотонического раствора NaCI).

Приготовление фиксированных тромбоцитов: венозную кровь донора стабилизируют 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1 в силиконированной пробирке. Богатую тромбоцитами плазму получают при центрифугировании в течение 5 минут при 1500 об/мин. Плазму разливают по 5 мл в центрифужные силиконированные пробирки и инкубируют на водяной бане 1 ч при 37^о, после чего к плазме добавляют 0,5 мл раствора ЭДТА и еще через 2 мин 5 мл фиксирующего раствора. Смесь выдерживают при 4 не менее12 ч, и она может быть использована в течение 14 дней, а при температуре - 10 -12^о в течение 2-3 месяцев. В день исследования смесь центрифугируют при 1000 об/мин в течение 20 минут, надосадочную жидкость сливают, осадок осторожно смешивают с 1 мл отмывочного раствора и оставляют на 1 ч при 4^о, после чего смесь вновь центрифугируют в том же режиме; надосадочную жидкость сливают, тромбоциты перемешивают в 1 мл суспензирующего раствора.

Подготовка бестромбоцитарной плазмы исследуемого: 0,1 мл крови выбирают после прокола кожи пальца и в силиконированной пробирке смешивают с 0,01 мл раствора цитрата натрия. Затем отделяют плазму по методу Т.А. Обута. Половина объема полученной плазмы разводится в 10 раз суспензирующим раствором.

Ход определения: В силиконированной пробирке смешивают 0,25 мл взвеси тромбоцитов, 0,2 мл изотонического раствора и 0,025 мл исследуемой плазмы. Полученную смесь и одновременно раствор ристомицина помещают на водную баню при 37^о, через 2 мин инкубации 0,05 мл раствора ристомицина вносят в пробирку с исследуемой смесью, немедленно включают секундомер. Определяют время образования первых видимых глазом агглютинатов тромбоцитов. В таком же порядке определяют время агглютинации тромбоцитов исследуемой плазмы, разведенной в отношении 1:10. Время агглютинации в секундах переводят в процентное содержание фактора Виллебранда по калибровочной кривой.

Построение калибровочной кривой. По описанной выше методике определяют время агглютинации на 10 смешанных образцах нормальной бестромбоцитарной плазмы здоровых доноров, которую разводят последовательно суспензирующим раствором - 1:5, 1:10, 1:20. Цельная плазма и каждое из ее разведений исследуются трижды, вычисляется среднее арифметическое значение. На билогарифмической бумаге по оси ординат откладывают время агрегации в секундах, а на оси абсцисс - процентное содержание фактора Виллебранда, активность которого в цельной смешанной плазме принимается за 100%, в разведении 1:5 - за 20%, 1:10 - за 10% и 1:20 - за 5%. Строится калибровочная кривая (рис. 18).

Рисунок 18. Калибровочная кривая для количественного определения фактора Виллебранда.

Оценка результатов: Результаты определения времени агглютинации фиксированных тромбоцитов в исследуемой цельной плазме и при разведении ее 1:10 откладывают на билогарифмическую бумагу. При правильной постановке исследования кривая должна быть параллельна контрольной кривой разведения. Процентное содержание ФВ экстраполируют, пользуясь графиками на стандартной кривой разведения (рис. 18).

Нормативные величины: 80 - 120%, в среднем 103,7 + 4,3%.

Клиническое значение: Фактор YIII обладает тремя видами биологической активности - прокоагулянтной (YIII - С), антигенной (YIII А) и фактора Виллебранда (YIII: ФВ). ФВ занимает узловое место во взаимодействии трех звеньев системы гемостаза - сосудистого, тромбоцитарного и коагуляционного. ФВ играет важнейшую роль как в процессе адгезии тромбоцитов, так и активации свертывания крови. Снижение уровня ФВ является основным признаком болезни Виллебранда, отличающим ее от других геморрагических диатезов, в том числе гемофилии А. Поскольку ФВ синтезируется в эндотелии сосудов, то повышение его уровня в плазме является одним из маркеров повреждения сосудистой стенки при различных предтромботических состояниях, тромбозах, системных микротромбоваскулитах и ДВС-синдромах.

Количественное определение фактора Виллебранда фотоэлектроколориметрическим методом (по Баркаган З.С., Момот А.П.,1999).

Принцип: Метод основан на определении фактора Виллебранда (ФВ), содержащегося в исследуемой плазме, на ристоцетин-индуцированную агрегацию фиксированных формалином донорских тромбоцитов. Обработанные формалином тромбоциты сохраняют способность к ристоцетин-агрегации, но не могут агрегировать спонтанно и под воздействием других индукторов агрегации.

Реактивы: 1. 3,8 % раствор цитрата натрия; 2. 0,2% раствор натриевой соли ЭДТА в 0,9 % растворе натрия хлорида (рН 6,4); 3. Фиксирующий раствор: 20 мл свежеприготовленного 40% раствора формалина растворяют в 1000 мл буфера (0,2 г динатриевой соли ЭДТА, 9,0 натрия хлорида, 0,5 г однозамещенного фосфорнокислого калия, 1,1 г двухзамещенного фосфорнокислого натрия, рН 6,4); 4. Отмывочный раствор: один объем 3,8 % раствора цитрата натрия и пять объемов 0,9% раствора натрия хлорида (рН 6,4). 5. Суспензирующий раствор: из тех же компонентов, что и отмывочный раствор, но рН =7,4. 6. Раствор для хранения тромбоцитов: 1,1 уксуснокислого натрия, 0,2 г динатриевой соли ЭДТА, 9,0 г натрия хлорида растворяют в 1000 мл дистиллированной воды (рН 6,4); 7. Раствор ристомицина: 6 мг ристомицина в 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида (готовят перед употреблением).

Приготовление фиксированных тромбоцитов: Кровь от 10 здоровых доноров забирают в силиконизированную посуду с добавлением раствора натрия цитрата (9:1), центрифугированием при 1500 об/мин в течение 6 мин. получают из нее богатую тромбоцитами плазму. Плазма выдерживается при комнатной температуре 1 час и еще 1 час при температуре 37^о С. Затем ее смешивают с раствором динатриевой соли ЭДТА в соотношении 9:1 и через 2 минуты добавляют равный объем фиксирующего раствора. Смесь выдерживается 1 час при температуре +2...+8^оС. После этого взвесь тромбоцитов центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость сливают, тромбоциты ресуспендируют в отмывочном растворе, равном i объема первоначально взятой плазмы. Ресуспендированные тромбоциты оставляют на 1 час при температуре +2...+8^о После этого взвесь тромбоцитов центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин. Надосадочная жидкость сливается, тромбоциты ресуспендируют в растворе для хранения в объеме, равном j объема первоначально взятой плазмы. Приготовленная таким образом взвесь тромбоцитов разливается по 1 мл в силиконизированные пробирки и немедленно замораживается при температуре - 16...-20^оС. Тромбоциты могут храниться длительно (1-2 мес) без существенного изменения их способности к агглютинации.

Оборудование: Фотоэлектроколориметр.

Ход определения: Фиксированные тромбоциты размораживают, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 20 минут, надосадочную жидкость сливают, тромбоциты ресуспендируют в 1 мл суспендирующего раствора (до оптической плотности 1,0).Оптическую плотность измеряют на ФЭК при зеленом светофильтре (640 нм) в кювете на 2 мл.

К 1 мл приготовленной взвеси тромбоцитов добавляют 0,6 мл физиологического раствора, 0,2 мл разведенной физиологическим раствором 1:1 исследуемой бедной тромбоцитами плазмы и 0,2 мл раствора ристомицина. Регистрируют оптическую плотность (ОП 1), затем смесь переливают в кювету на % мл и перемешивают в течение 2 минут с помощью магнитной мешалки. Вновь переносят в кювету на 2 мл и повторно измеряют оптическую плотность (ОП 2). Вычисляют индекс агглютинации (ИА).

ИА = (ОП 1 - ОП 2) / ОП 1

Интенсивность перемешивания эмпирически подбирают т.о., чтобы концентрация тромбоцитов и ОП 1 были в пределах 0,7 - 0,8, а ОП 2 - 0,3 - 0,4.

Процентное содержание ФВ определяют по калибровочной кривой. Если полученные результаты выходят за пределы калибровочного графика, то исследование повторяют с разведенной в 2 раза физиологическим раствором плазмой, а результат умножают на 2.

Построение калибровочной кривой: Готовят смесь из 10 образцов нормальной бедной тромбоцитами плазмы из крови здоровых доноров. Из этой смеси готовят разведения в 2, 4, и 8 раз. Первое разведение принимается за 100%, второе - за 50%, а третье - за 25% активности ФВ. Исследуют ФВ по описанной выше методике. Кривая строится в билогарифмических координатах. Для каждой вновь приготовленной взвеси фиксированных тромбоцитов и серии ристомицина строится отдельная калибровочная кривая.

Нормальные величины: 80 - 120%.

Оценка результатов и клиническое значение: Понижение активности ФВ характерно для большинства форм болезни Виллебранда. Значительное повышение активности ФВ наблюдается при острых тромбозах, некоторых тромбофилиях, ДВС- синдроме, поражениях сосудистой стенки и свидетельствует об усиленном выделении ФВ в кровь.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 720 | Нарушение авторских прав